杏鲍菇液体菌种产业化应用关键技术研究

王 衍，刘 洋，黄国庆，刘 敏，陈 浩，胡 琼

（1.江苏海洋大学，江苏连云港222005；2.连云港磨圣如食品有限公司，江苏连云港222100；3.连云港兴菇生物科技有限公司，江苏连云港222100）

长期以来，食用菌液体菌种在我国没有被广泛推广的主要原因之一是发酵条件与工艺技术的不成熟。国内对液体菌种的研究大都停留在实验室阶段，基本是使用三角瓶模拟食用菌发酵罐的生长环境进行相关试验[1]。近年来，液体菌种的生产伴随着食用菌工业化发展取得了很大进步[2-3]。食用菌规模化、工厂化的生产中50%以上已采用液体菌种生产方式，液体菌种通过工厂化设备流水线接种，最终产出菇品不仅效率高而且品质佳[4]。但在具体实施过程中，仍会出现液体菌种活性和出菇产量不稳定的现象，使较多规模小、风险承受能力低的中小型企业对液体接种技术望而却步，限制了液体菌种的进一步推广应用。该文根据和企业在食用菌种植及生产实际合作中的多年经验及具体情况，以杏鲍菇的育种、栽培、培育为例，就食用菌接种方式由传统固体向液体转变过程中存在的主要问题和关键技术研究展开论述，以期为食用菌液体菌种的产业化应用提供经验借鉴。

1 接种技术对比分析

1.1 固体接种

固体接种为食用菌生产最初采用的主要接种手段，因为多采用枝条进行，也叫作枝条接种法。目前，食用菌固体接种技术多为手工操作，由此存在劳动强度大、人员密集程度高的问题。对生产企业造成的主要影响是生产效率低、费工费时，且杂菌的污染率较高，同时由于固体接种法的科技含量低，无法较好地保证接种的质量，对企业的正常生产会造成一些不可控的影响。固体接种在具体实施过程中，一般多选用木质枝条形式，江苏地区杨树种植广泛及杨树枝条的优良特性，接种枝条多选用杨树枝条（图1）。

图1 固体接种用枝条

枝条式固体接种的前期准备工作，主要包括对培养基进行灭菌处理，添加固体状菌种颗粒。这一工序在实际生产中耗时较长，由于添加的菌种颗粒大小不一、很难确保培养基具有较好的均匀性，而且当菌种颗粒的添加量达不到规定的设定值要求时，还会造成菌丝繁殖困难，大大增加培养时间。在正常固体菌种培养过程中，还要注意栽培器皿外其他菌类的侵入，防范不当会对食用菌菌丝的良性繁殖造成影响。当采用枝条培养菌种时，要保证枝条与基料搅拌充分、均匀，然后将枝条装入菌袋（底部应有少许辅料），采用辅料将菌袋一端空隙部分填实，使得枝条表面留有少量辅料，最后采用套环对菌袋封口，随即放入灭菌框进行灭菌准备。

1.2 液体接种

液体接种技术具有方便快捷、菌期短、一致性好、纯度高、活力强等诸多优势[5-6]，已成为国内外食用菌生产的主流接种手段。主要接种形式为表面接种方式、表面结合枪头插入式接种方式、表面扎孔式接种法、袋壁内喷射接种法、接种后摇动接种法及自动接种机接种法等。为适应产业化生产，企业中多采用自动接种机进行液体接种，自动接种机可连续完成自动运输、定位、启盖、压脚和喷射接种等多道工序作业，接种生产率可达7 000瓶/h[7]。另一方面，通过对多家食用菌企业的调研发现，企业引进液体接种法以后，出现的最大问题就是单瓶的出菇产量不稳定，极大地影响了企业的成本和收益，已成为制约食用菌液体菌种技术进一步推广应用的关键性技术问题。

1.3 2种接种方式对比（表1）

表1 固体接种与液体接种优缺点对比

2 液体菌种的培养及关键技术

2.1 工艺流程

相比于固体菌种，虽然液体菌种的制作和接种工艺较复杂，但其整个发菌周期较短，设备操作简便且效率也较高。该文结合公司生产实例，选择杏鲍菇为研究对象，其具体工艺流程主要包括培养基制作及分装环节、杀菌冷却环节、入罐环节及最后接种环节（图2）。

图2 杏鲍菇液体菌种接种工艺流程

2.2 杏鲍菇培养基制作技术

2.2.1 杏鲍菇PDA试管培养基制作。根据食用菌液体菌种特点及实际生产要求，选用18 mm×180 mm的试管规格即可满足要求。针对公司生产的产品主要为杏鲍菇，配方主要有：马铃薯100~200 g、葡萄糖10~20 g、琼脂10~20 g、水800~1 000 mL、蛋白胨3~5 g、KH2PO42~3 g、MgSO41.0~1.5 g、pH取 自 然值，选择硅胶塞进行试管封口。

2.2.2 杏鲍菇母种培养基的制作。在以上配方选定之后，首先进行材料蒸煮，将约1 000 mL的水置于锅内烧煮，待沸腾以后加入约200 g加工好的马铃薯继续蒸煮20~30 min左右，通过纱布过滤后得到滤液。这一过程的关键是加水量，需要根据实际情况中的蒸发情况而定。下一步工序为琼脂溶解及补水，经过上述环节后补水约1 000 mL，沸腾后添加琼脂，溶解后再次补水。期间需要加入适量的葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、蛋白胨等。最后通过分装、加棉塞、灭菌、洪绵塞、摆斜面等工序可完成杏鲍菇母种培养基的制作，其中关键步骤为分装工序，需要注意避免培养液黏附在试管口，使得棉塞也被培养基黏附，这会增大整个培养基被污染的风险，进而对后面工序产生影响。

2.2.3 PDA试管的接种及培养。PDA试管的接种过程应在接种箱内或者环境超净的工作台中进行，关键环节在于接种管PDA空白斜面菌种试管间的无菌衔接，期间与火焰配合的灼烧方法和程度需要反复练习，确保效率的同时更要保证不被带菌空气污染。多采用恒温箱进行恒温环境下的PDA试管培养，确保温度恒定及避光要求，对于大多数菌类而言，培养温度一般介于22℃~25℃，对于草菇菌类，温度稍高约为35℃左右。

2.2.4 PDA试管母种的保藏。PDA试管母种需要专用的保藏设备，要求温度稳定、结霜较少，一般选用专用微生物菌种保藏冰箱。入藏的菌种培养间不能太久，以免菌种的活性被降低。同时确保试管棉塞没有受潮、封口没有破裂，需定期检查，确保菌种水分适宜和未被污染。

2.2.5 摇瓶菌种的制作。针对杏鲍菇类菌种，配方一般为：马铃薯100~200 g、葡萄糖5~10 g、白糖5~10 g、蛋白胨3~5 g、磷酸二氢钾2~3 g、硫酸镁1~1.5 g、水约800~1 000 mL、黄豆粉5~8 g、白糖20 g左右；摇瓶的制作流程一般为：称量、溶解→分装→加棉塞→灭菌→烘干棉塞→冷却等。然后选用三角瓶进行接种，接种后将三角瓶置于磁力搅拌器上搅拌，转速约为800~1 000 r/min即可，选择适宜于菌种类型的温度区间，搅拌时间约为1~2 d；之后继续将三角瓶置于旋转摇床，摇床转速约为120~150 r/min，摇转时间约为4~6 d；当三角瓶在摇床上的菌球浓度达标后，再将三角瓶置于磁力搅拌器中，转速约为1 000~1 300 r/min，时间为1~2 d，通过以上步骤可使摇瓶菌种具有合理的菌球及原始发菌点。

2.3 发酵罐培育罐体设计

相比于固体接种方式，液体接种需要特制的培育罐体——发酵罐（图3），整个工作系统由罐体、压力表、视镜、安全阀、空气过滤器、排气阀、进气阀、加热冷却水进出口等组成。依据生产企业要求，进行固体接种向液体接种的生产转变，选用的液体菌种发酵罐的罐体材料和其上阀门、管道、过滤器等材料皆采用优质不锈钢，对罐体的内部和外部都进行抛光作业；发酵培育系统的搅拌方式为气体环流形式，此种形式具有操作便捷、结构简单等优点[8]。罐体上的空气过滤器选用高精度过滤器，确保绝对过滤，避免杂菌污染，液体菌种的灭菌和发酵培育过程都可以在发酵罐内完成。过滤器分上下2个过滤器，拆装方便，但目前此类罐体主要的缺点是内部清洁不易彻底，为解决这个问题，在清洗罐体时先通入蒸汽，然后使用高压水枪对罐体内部，特别是对角落进行冲洗，此种方法对罐体内部具有良好的清洗效果。

图3 发酵罐结构

2.4 发酵罐内部气体输送系统布置

气体的输送和压缩设备统称为输送机械，发酵罐内部气体输送管道布置方式见图4。杏鲍菇菌种为好氧菌，需要利用往复式空压机向发酵罐中注入压力为0.2~0.3 MPa的高压空气。往复式空压机的工作原理类似于往复泵的结构，气缸外面需要配备相应的冷却装置，为保持正常、持续的供气，一般选用水冷冷却。

图4 发酵罐内部管道系统

2.5 发酵罐的电控系统设计

液体菌种的发酵罐电控系统主要包括主控箱体、控制开关、LED显示屏、报警器、集成仪表测控等部分组成。该系统具有温度自控、工作时间、罐内压力自控的优点控制界面示意图（图5）。

图5 控制界面

2.6 液体菌种自动接种技术

食用菌工厂化生产过程中，固体菌种接种方法存在工序间切换耗时长、接种后菌种大小不均匀的问题。尤其是当菌种的充填量在设定量以下时，会造成栽培时菌丝在容器内繁殖困难，进而会耗费较长的培养时间。目前，随着液体菌种快速占领市场，出现了较多的自动接种设备，在提高接种工作效率的同时，可以精确调节单次的注菌量，确保接种容器内的菌种数量稳定、充足，相关全套设备可在市场上直接购买。

根据接种要求及产业化水平，企业选择购买的自动接种设备为浙江金华地区相关企业生产的液体菌种自动接种机（图6），接种机可自动完成运输、定位、启盖、注菌、加盖等工序。该设备一共购买3台，可形成70 000瓶/d的生产能力，完全满足企业的实际需求。

3 实际应用中存在问题

该文从企业引进液体接种技术后面临的单瓶出菇产量不稳定、整体菌菇产出量偏低的问题出发，阐述造成这一现象的主要因素及应对办法。单瓶出菇产量直接决定了整个液体接种技术的菌菇产出量，也决定了企业的经济效益，是企业经营成败的关键。企业在引进液体接种技术后，单瓶出菇产量起初没有达到预期值，经过调整后逐渐恢复至正常水平，现梳理总结发现存在的主要问题。

3.1 专用设备匹配不规范

目前，国内各地的液体接种设备和水平有较大差距，特别是在液体菌种的培养、自动接种方面仍存在不足[9-11]。公司为实现自动接种、提高生产效率，购买了3台自动接种设备，短时间使用较好，连续使用超过1个月左右机器会出现卡机、注菌量不均匀和接种点偏移等问题。经检测维修后，问题主要是以下几点：①操作顺序随意、不规范；②使用过程中保养不够，长时间使用超过1周左右需对关键部件做润滑、去污处理；③缺少对循环运动部件的预紧情况进行检测，预紧力不足或松动后会出现注菌定位不准、出现偏移的情形。以上问题的发现，希望对菌菇类企业在生产中遇到类似问题时提供方法借鉴。

图6 液体菌种自动接种机

3.2 产业化生产技术储备不足

一方面，就企业生产而言，不仅要保证整个菌种培养直至出菇阶段每个环节的良好衔接，而且还要实现企业的最低产业化指标。从目前国内食用菌的生产现状来看，绝大多数环节都已经实现了自动化或半自动化的生产加工，但在菌包培育-出菇阶段，由于育菇和出菇环境要求的不同，需要对菌包进行转运。这一阶段的产业化设备较少，会产生大量的人员用工，这一过程也增加了菌菇生长阶段的不确定性风险，可见，如何实现菌包培育-出菇阶段的自动化转运或环境的自动控制设计，进一步降低成本，已成为食用菌生产企业急需解决的技术难题。

另一方面，国内液体菌种实际产业化时间不长，其关键的液体菌种产业化技术储备也不够充分，特别是液体发酵罐的产业化培养及高效率注菌设备，相关技术虽然在实验室阶段已不存在技术瓶颈，但是在实际产业化应用中依旧存在较多技术问题。

3.3 菌丝活性的随机性波动较大

与企业生产合作中发现，企业的关切点在于优良菌种的选育，这也是菌类企业的核心竞争力，为此，许多企业不惜投入巨额资金与高校、研究院所进行科研合作。在进行液体菌种接种法的推广中发现，即使选用同一型号的菌种，经过育菇、出菇等作业后，采用液体菌种接种法得到的出菇产量也是不稳定的，与固体接种法相比，单瓶产量偏低、随机性波动较大。初步分析后认为，一方面需要进一步调整培养基环境及育菇出菇阶段生产参数，另一方面建议在菌种选育过程中，也要充分考虑液体菌种的技术特点和模式，尽量使得菌丝活性在各种环境下波动性较小，以此获得的液体菌种的单瓶出菇产量较稳定，有利于产业化推广。为提高液体菌种的单瓶出菇量，除了以上问题以外，对于企业而言，还应进一步在优质菌种的选育上下功夫；在菌种培养、制作、发酵直至接种系列过程中，要严格执行相关标准，并通过培养基检测、镜检，保证接种、培养环境，杜绝污染杂菌的现象发生。

4 结语

该文结合实际中与企业的产学研合作，阐述了在食用菌栽培过程中，由固体接种转变为液体接种过程中需要考虑的关键技术因素和需要具备的条件，就目前而言，面向液体菌种接种技术的专业性设备、产业化生产技术及菌种菌丝的活性和产量不稳定等因素是制约液体菌种推广的关键因素，以期为食用菌液体菌种接种模式的推广和完善高效的工厂化栽培技术提供良好的实践借鉴。