肌醇依赖酶1α调控下胰岛β细胞凋亡和衰老的关系

张晓亮 汪雷 柏新乐

随着我国社会的老龄化日益加剧，衰老及其相关疾病成为危害人类健康的重要疾病之一。流行病学调查结果显示，中国成年人糖尿病的患病率随着年龄增加而同步升高，同时，高龄孕妇是妊娠期糖尿病的高危人群，表明衰老是糖尿病发病的危险因素[1]。胰岛β细胞增殖是出生后维持胰岛β细胞数量稳态的主要来源，胰岛β细胞数量的绝对或相对缺乏是糖尿病的基础病因[2-3]。研究显示，小鼠及人类胰岛β细胞的增殖率在出生一段时间后逐渐降低，人类胰岛β细胞数量在成年后迅速下降，直到60岁以后下降幅度逐渐减小[4-6]。不仅如此，胰岛β细胞在外界刺激作用下可代偿性增殖，而衰老胰岛β细胞虽然存在增殖潜能，但诱导增殖率很低[7]。因此，阐明年龄影响胰岛β细胞增殖的机制、研究如何提高衰老胰岛β细胞增殖能力，对衰老引起的糖尿病具有重要意义。哺乳动物肝脏中的肌醇依赖酶1α(IRE1α)作为细胞感应机体营养变化的感应分子，能激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)及Caspase-12介导内质网应激诱导的凋亡[8]。有研究结果显示，抑制IRE1α通路可减少胰岛细胞凋亡，但其在衰老影响胰岛β细胞增殖中的调控作用目前尚不明确[9]。本研究通过检测不同周龄小鼠中IRE1α/JNK信号通路的活性及胰岛细胞的增殖水平，旨在探究IRE1α表达在衰老影响胰岛β细胞凋亡中的作用。

材料与方法

1.材料：雄性野生型C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物中心；IRE1α flox/flox小鼠和胰岛β细胞特异性表达(RIP cre)的小鼠均由南京模式动物中心构建；小鼠30天断奶后均一直饲养在SPF级动物房中，可任意进食及饮水；动物房保持温度(22±2)℃，湿度(35±4)%，12小时昼夜周期(早晨7时亮灯)；动物证号：SCXK(沪)2018-002，伦理审查受理号：2018101023。胰岛素试剂盒购自millipore公司(美国，货号EZRMI-13k)；血糖仪和血糖试纸购自雅培(美国)；蛋白酶抑制剂购自Sigma-Aldrich公司(美国，货号s193-2)。磷酸化肌醇依赖酶1α(p-IRE1α)抗体(货号10255-1)、IRE1α抗体(货号10124-s)、天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗体(货号65432-1)、细胞周期素D2(cyclin D2)抗体(货号23532-1)、微管蛋白(Tubulin)抗体(货号112334-1-AP)均购自Proteintech公司(美国)。胰腺十二指肠同源盒-1(PDX-1)抗体(货号3456-S)、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(chop)抗体(货号2452-s)购自Cell Signaling Technology公司(美国)。

2.方法

(1)分组与模型建立：取雄性野生型C57BL/6小鼠50只；另将IRE1α flox/flox和RIP cre这两种c57背景的小鼠交配筛选出胰岛β细胞特异性敲除IRE1α的小鼠作为实验组(IRE1α-IKO)，IRE1α flox/flox小鼠(RIP cre阴性)作为对照组(IRE1α-WT)，每组各20只。小鼠均饲养至8周龄开始实验，分别饲养6周(14周龄)、12周(20周龄)、24周(32周龄)、36周(44周龄)、48周(56周龄)，建立不同周龄小鼠衰老模型。C57BL/6小鼠于14周龄、20周龄、32周龄、44周龄、56周龄检测血糖、血清胰岛素后处死取胰腺组织块，于液氮中短暂保存，之后置入-80 ℃冰箱贮存用于蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测；实验组、对照组小鼠于14周龄、20周龄、32周龄、44周龄检测血糖、血清胰岛素；56周龄时，一半进行葡萄糖及胰岛素耐量试验，一半处死取胰腺组织块，于液氮中短暂保存后置入-80 ℃冰箱贮存用于Western blot检测。

(2)小鼠血糖检测：小鼠饥饿4 h后，采用血糖仪检测小鼠的尾尖血糖，将血滴滴在试纸上然后读取血糖值，最后用纱布或棉球对鼠尾压迫止血。

(3)小鼠血清胰岛素检测：采用戊巴比妥钠麻醉小鼠，心脏取血后于4 ℃、以3 000 r/min离心10 min获得血清。采用小鼠胰岛素试剂盒(货号EZRMI-13k，检测范围为0.2～10.0 ng/ml)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其血清中胰岛素含量，操作如下：小鼠血清按1∶10比例稀释，每个样品检测3个复孔，使用酶标仪读取吸光度，使用胰岛素标准品及标准品吸光度制作标准曲线，计算血清中胰岛素含量。

(4)葡萄糖及胰岛素耐量试验：小鼠饥饿16 h后进行葡萄糖及胰岛素耐量试验，操作如下：将葡萄糖溶解于生理盐水中，按1.5 g/kg小鼠体重的剂量进行腹腔注射(每个周龄组6只)；将胰岛素稀释于生理盐水中，按1 U/kg小鼠体重的剂量进行腹腔注射(每个周龄组6只)。注射前及注射后30 min、60 min、120 min使用血糖仪测量尾静脉血糖值。操作时保持小鼠安静状态，每只小鼠操作间隔保持一致。

(5)Western blot检测p-IRE1α、IRE1α、Caspase-3、PDX-1、cyclin D2、Tubulin、chop蛋白：采用RIPA裂解液裂解胰岛组织后，进行蛋白浓度测定，再用6×上样缓冲液制样，上样电泳、滤纸-凝胶-聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜-滤纸夹心转膜。然后用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭PVDF膜1 h。封闭结束后，孵育抗体，最后加入电化学发光(ECL)结合底物反应、曝光显影。

结 果

1.不同周龄野生型C57BL/6小鼠随机血糖水平变化：野生型C57BL/6小鼠随机血糖水平在32周开始明显升高，32周龄[(8.7±0.9) mmol/L]、44周龄[(10.1±1.1) mmol/L]、56周龄[(11.7±1.8) mmol/L]与14周龄[(6.3±1.1) mmol/L]小鼠比较差异均有统计学意义(P<0.05)，20周龄[(6.4±1.2)mmol/L]与14周龄小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.不同周龄野生型C57BL/6小鼠胰岛增殖/凋亡相关分子的表达水平：从32周开始，野生型C57BL/6小鼠的IRE1α磷酸化水平及Caspase-3水平均明显高于14周龄小鼠，PDX-1和cyclin D2的表达水平明显低于14周龄小鼠(P<0.05)。见图1、表1。

图1 不同周龄野生型C57BL/6小鼠胰岛增殖/凋亡相关分子的表达水平比较

表1 不同周龄野生型C57BL/6小鼠胰岛增殖/凋亡相关分子表达水平比较

3.不同周龄实验组和对照组小鼠随机血糖和胰岛素水平比较：实验组小鼠随机血糖水平从32周开始明显低于对照组(P<0.05)；实验组小鼠血清胰岛素水平从20周开始明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同周龄实验组和对照组小鼠随机血糖和胰岛素水平比较

4.实验组和对照组高龄小鼠糖耐量和胰岛素耐量比较：选取56周龄的两组高龄小鼠检测糖耐量和胰岛素耐量，结果显示，实验组小鼠在腹腔注射葡萄糖溶液的30 min、60 min、120 min后糖耐量明显低于对照组，实验组小鼠在腹腔注射胰岛素溶液的30 min、60 min、120 min后胰岛素耐量明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 实验组和对照组高龄小鼠糖耐量和胰岛素耐量比较

5.实验组和对照组高龄小鼠胰岛中增殖和凋亡相关分子表达比较：选取56周龄的两组小鼠，检测其胰岛中cyclin D2和IRE1α信号通路下游凋亡相关分子chop的表达结果显示，高龄实验组小鼠cyclin D2的表达水平(1.0±0.2比2.7±0.4)较对照组明显增加，而IRE1α信号通路下游凋亡相关分子chop表达水平(0.9±0.3比0.3±0.1)较对照组明显降低(P<0.001)。见图2。

图2 实验组和对照组高龄小鼠胰岛中增殖和凋亡相关分子表达水平比较

讨 论

胰岛β细胞的增殖率在青少年期迅速减少，在成年期下降速度变慢，其降低幅度对老年人胰岛细胞的增殖尤为重要[10]。研究表明，啮齿动物、人类胰岛β细胞的增殖速率在出生后迅速下降，而β细胞增殖速率的降低与粘附分子E-钙粘素(E-cadherin)水平有关[11-12]。另有研究发现，在结直肠癌细胞中，IRE1α的沉默或高表达可影响E-cadherin水平[13]。本研究通过检测IRE1α信号分子在不同周龄小鼠胰岛中的表达，并通过IRE1α胰岛敲除小鼠探究相关的分子机制，结果显示，IRE1α基因敲除小鼠胰岛素水平较野生型小鼠增加，同时胰岛素耐量和葡萄糖耐量改善，提示敲除IRE1α的高龄小鼠胰岛β细胞功能或数量高于对照组，同时表明IRE1α信号通路可能参与调控年龄相关的胰岛细胞功能或数量，抑制IRE1α功能可提高衰老β细胞应对外界增殖刺激的增殖反应，促进胰岛β细胞增殖以满足机体对胰岛素的需求。

随着年龄增长，胰岛对外部增殖信号的应答反应下降，即胰岛细胞表现为年龄相关的增殖能力下降[11]。但随着年龄增加，胰岛素受体、催乳素受体及胰岛β细胞增殖的内源性调节因子如Foxo-1水平变化较小，表明细胞凋亡是参与调控小鼠及人的年龄相关的胰岛β细胞数量的主要机制[14]。有研究结果显示，IRE1α/JNK通路中JNK磷酸化具有促进P21泛素化降解的作用，间接抑制P21介导的cyclins/cdks复合物的核转位，导致cyclin D2翻译及转录因子E2F激活降低，增殖减少[15]。另有研究表明，chop促发细胞凋亡的作用与其作为转录因子的功能相关，其可诱导一些促凋亡蛋白质的转录表达，同时还会降低抗凋亡基因BCL2的表达，并且通过招募TRAF2激活细胞质中的Caspase-12，触发启动细胞的凋亡程序[16]。

本研究结果显示，随着小鼠周龄增加，胰岛β细胞内质网应激损伤增加，IRE1α信号通路激活，提示IRE1α信号通路激活可能参与了调控胰岛β细胞增殖和凋亡相关因子表达。进一步探究发现，高龄胰岛β细胞IRE1α敲除小鼠(IRE1α-IKO)较野生型小鼠的血糖代谢有所改善，其PDX-1和cyclin D2表达均较野生型增多，凋亡相关因子chop表达降低。鉴于PDX-1和cyclin D2作为年龄相关胰岛β细胞增殖的主要调控因子调节胰岛β细胞细胞周期的进程，提示IRE1α可能为β细胞年龄相关增殖下降的因子之一，IRE1α信号通路在年龄介导的胰岛β细胞凋亡中发挥重要的调控作用。

综上所述，IRE1α信号通路激活可能参与了衰老增加胰岛β细胞凋亡率的过程，即老年糖尿病的发生可能与IRE1α信号通路激活有关，而敲除IRE1α可促进高龄小鼠胰岛中增殖相关因子表达，并降低凋亡相关因子表达，改善小鼠血糖代谢，这可能为治疗老年糖尿病提供新思路。