基于“健脾益气法”观察绞股蓝乌龙保健茶对小鼠血清免疫功能的影响

陈洪德, 陈旭丰, 林仁穗, 邹双全, 阮国洪, 杨素芳

(1.福建农林大学资产经营管理有限责任公司,福建 福州 350002；2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350002;3.福建农林大学资源与环境学院,福建 福州 350002；4.福建农林大学林学院,福建 福州 350002；5.福建医科大学卫生检验与检疫学系,福建 福州 350108；6.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108)

由于生活节奏快、工作压力大、作息缺规律等因素，现代人的免疫力普遍下降，多数成年人处于亚健康状态.鉴此绞股蓝乌龙保健茶应运研制，适用于亚健康人群食用，对提高人体免疫功能和防治疾病具有重要意义.

绞股蓝乌龙保健茶选用绞股蓝、乌龙茶和黄芪为原料，经科学配比加工而成.研究表明，绞股蓝总皂甙可促进T、B淋巴细胞的增殖，增强IL-1和IL-2的活性，提高血清溶血素水平和脾脏指数等[1-4]；绞股蓝多糖能增强自然杀伤(natural killer, NK)细胞活性，提高淋巴细胞转化[5-6]；茶多酚可增加小鼠的体重、脾重和IgG含量，诱导产生TNF-α和IL-2[7-8]；茶多糖可调节小鼠IL-2和IL-1的分泌[9-10]；茶氨酸复合制剂可增强细胞免疫和体液免疫[11]；黄芪多糖能增强气虚小鼠吞噬细胞的吞噬能力，恢复胸腺和脾脏的功能[12-14]；黄芪甲苷能改善免疫各项指标，减轻大鼠免疫性肝损伤[15-16].可见，绞股蓝乌龙保健茶的主原料含有明显提高机体免疫力的多活性成分.

《脾胃论》载：“百病皆由脾胃衰而生”，脾胃气盛，正气不虚，不招外邪，维体强健，否则气血不足而机体的免疫力低下.本研究选用的主原料不仅具有能增强免疫的功能因子，而且都有“健脾益气”的功效，通过“健脾益气法”探究绞股蓝乌龙保健茶增强免疫的功能.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 绞股蓝乌龙保健茶由福州福万生物技术工程有限公司生产.

1.1.2 试验动物 选用上海斯莱克实验动物有限责任公司提供的清洁级ICR雌性小鼠200只[许可证号：SCXK(沪)2012-0002]，体重18～22 g，饲养于福建省疾病预防控制中心SPF级动物实验室[许可证号：SYXK(闽)2012-0008].

1.1.3 仪器与试剂 仪器包括2-16K台式离心机、Co-150型C02恒温培养箱、MODEL680酶标仪、UV-1800紫外可见光分光光度计、Olympus Ⅸ71倒置显微镜.

试剂包括注射用墨汁、刀豆蛋白A、MTT、DNFB、丙酮、SRBC、鸡红细胞、羊红细胞、Giemsa染液、YAC-1细胞、Hank′s液(pH 7.2～7.4)、RPMI1640完全培养液、乳酸锂、典硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)、1% NP40、酸性异丙醇、台酚兰等.

1.2 样品配制

在900 g绞股蓝乌龙保健茶中加入10倍量的蒸馏水，于85 ℃、常压下浸泡30 min后过滤，重复该步骤1次，合并2次滤液，于65 ℃、减压条件下浓缩至6 L(该浓缩液含样品0.15 g·mL-1).量取100 mL浓缩液作为高剂量组试验样品；量取40 mL高剂量组试验样品加蒸馏水至120 mL，作为中剂量组试验样品；量取40 mL中剂量组试验样品加蒸馏水至80 mL，作为低剂量组试验样品.

1.3 试验设计

样品按60 kg体重的成年人每天推荐用量(6.0 g·d-1，即0.1 mL·kg-1)的5、10和30倍，设置0.5、1.0和3.0 g·kg-1高、中、低3个剂量组和空白对照组.将200只小鼠按体重分成5个大组，即免疫Ⅰ～Ⅴ组，每组40只.免疫Ⅰ组进行脏器指数测定、溶血空斑和血清溶血素试验；免疫Ⅱ组进行迟发型变态反应水平试验；免疫Ⅲ组进行NK细胞活性测定和脾淋巴细胞转化试验；免疫Ⅳ组进行碳廓清试验；免疫Ⅴ组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验.上述试验均按《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)[17]的方法进行.

再按照体重将小鼠随机分为4个小组，每组10只.小鼠以20 mL·kg-1的剂量每天灌胃1次绞股蓝乌龙保健茶，连续30 d后测定血清免疫功能指标.

1.4 指标的测定

采用《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)[17]的方法测定各处理小鼠血清免疫功能指标.

1.4.1 淋巴细胞的增殖能力 用酶标仪测定570 nm波长处的光密度(D).用△D表示淋巴细胞的增殖能力.△D=D(加刀豆蛋白的A孔)-D(不加刀豆蛋白的A孔).

1.4.2 迟发型变态反应程度 用左右耳重量之差表示迟发型变态反应程度.

1.4.3 抗体细胞生成能力 用空斑数/全脾细胞表示抗体细胞生成能力.

1.4.4 血清溶血素水平 血清凝集程度一般分为0～Ⅳ级.抗体积数=(S1+2S2+3S3……nSn).式中，1、2、3…n表示对倍稀释的指数，S表示凝集程度的级别.抗体积数越大，表示血清抗体水平越高.

1.4.6 腹腔巨噬细胞的吞噬能力 显微镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，计算吞噬百分率和吞噬指数.吞噬百分率/%=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数)×100;吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数.

1.4.7 NK细胞活性 NK细胞活性/%=[D(反应孔)-D(自然释放孔)]/[(D(最大释放孔)-D(自然释放孔)]×100.

1.5 数据处理

试验重复10次，结果以平均值±标准差表示.采用SPSS软件进行单因素方差分析.经方差齐性检验，方差齐的数据采用LSP法进行统计分析，方差不齐的数据采用Tambane法进行统计分析[18].

2 结果与分析

2.1 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠体重的影响

由表1可见，样品各剂量组小鼠的体重都有不同程度的增加，但与空白对照组的增加程度比较接近，差异不显著(P>0.05).

表1 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠体重的影响Table 1 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on weight of normal mice g

2.2 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠免疫器官的影响

表2 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠免疫器官的影响1)Table 2 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on immune organ of normal mice

由表2可见，样品各剂量组小鼠的脾脏指数、胸腺指数与空白对照组的差异均无显著性(P>0.05).

2.3 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠细胞免疫功能的影响

2.3.1 对刀豆蛋白A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响 由表3可见，样品高剂量组小鼠脾淋巴细胞的增殖能力与空白对照组的差异显著(P<0.05).

2.3.2 对小鼠迟发性变态反应的影响 由表3可见，样品各剂量组小鼠左右耳重量之差与空白对照组的差异均无显著性(P>0.05).

2.4 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠体液免疫功能的影响

2.4.1 对小鼠抗体细胞生成能力的影响 表3显示，各剂量组样品均可提高小鼠的溶血空斑数，高剂量组与空白对照组的差异显著(P<0.05)，表明绞股蓝乌龙保健茶能促进抗体细胞的生成.

表3 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠细胞免疫和体液免疫功能的影响1)Table 3 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on cellular immunity, humoral immunity of normal mice

2.4.2 对小鼠血清溶血素水平的影响 表3显示，各剂量组样品均能提高小鼠抗体积数，抗体积数随着样品剂量的增加而提高，高剂量组与空白对照组的差异显著(P<0.05)，表明绞股蓝乌龙保健茶可以显著提高小鼠血清溶血素水平.

2.5 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠单核—巨噬细胞功能的影响

2.5.1 对小鼠碳廓清能力的影响 表4显示，样品高剂量组小鼠的吞噬指数a明显高于空白对照组(P<0.05)，表明绞股蓝乌龙保健茶可以显著提高小鼠碳廓清能力.

表4 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠碳廓清能力、巨噬细胞吞噬能力和NK细胞活性的影响1)Table 4 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on carbon clearance, macrophage phagocytosis, natural killer cell activity of normal mice

2.5.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响 表4显示，样品各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数、吞噬率与空白对照组的差异不显著(P>0.05).

2.6 绞股蓝乌龙保健茶对小鼠NK细胞活性的影响

表4显示，高剂量组小鼠NK细胞活性明显高于空白对照组(P<0.05).

3 讨论与结论

中医学认为，脾为气血生化之源，经脾化生的“卫气”能保卫肌表、抗御外邪，类似于西医学的免疫预防功能；经脾化生的“营气”能化生血液、营养全身，类似于西医学的免疫自稳功能；“脾主谏议之官”能纠正身体受损，类似西医学的免疫监视功能.可见，中医脾化生的“卫气营血”与西医学的“免疫”具有相关性，脾气旺盛则免疫功能强大.

根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)[17]有关增强免疫力功能的判定标准，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面中有任何两项结果呈阳性，可判定该受试样品可增强免疫力.

在本研究条件下，高剂量绞股蓝乌龙保健茶明显增强刀豆蛋白A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力，明显提高小鼠NK细胞活性，抗体生成细胞检测和血清溶血素测定结果均呈阳性.表明绞股蓝乌龙保健茶具有增强免疫力的功能.

绞股蓝乌龙保健茶通过“健脾益气法”能提高细胞免疫功能，促进胃肠、肾、肺等多脏器功能的恢复[18-21].分析本研究主原料的中药性能，其中，绞股蓝健脾补肾，乌龙茶温脾健运，黄芪补脾益肺，三药配伍后协同发挥“健脾益气”的功效.与前人所见略同，本研究结果显示了绞股蓝乌龙保健茶通过“健脾益气法”的增强免疫作用，符合张仲景“四季脾旺不受邪”的观点，体现了健脾强体是“治未病”的重要原则，也是本研究绞股蓝乌龙保健茶临证养生的理论依据.