肺癌患者miR-21靶基因挖掘及其在血清中的表达与诊断价值①

王文栋 裴泽浩 席小雪 崔伟亮 张 彤 常晓彤（河北北方学院医学检验学院，张家口075000）

肺癌严重危害人类健康，其发病率、死亡率均居恶性肿瘤之首［1］。随着科学技术和精准医学的不断发展，肺癌治疗手段有所提升。但由于大部分患者明确诊断时已发展至中晚期，手术治疗效果甚微［2］。因此，寻找非侵入性、高灵敏度、高特异性的肺癌肿瘤标志物的意义重大。

有研究表明，微小RNA（microRNAs，miRNAs）的表达与肺癌的发生、发展密切相关，在肺癌肿瘤细胞的黏附、浸润和扩散过程中发挥重要调节作用［3］。由于miRNAs在肿瘤组织和外周血液中表达相对稳定，组织特异性较高，使其在肺癌诊断和分型中的应用成为可能，具有探索价值［4］。既往研究发现，miR-21不仅在肺癌患者的肿瘤细胞中表达升高，其在外周血中表达水平也高于正常人群，与肺癌的发生、发展、转移和预后不良有关［5］。鉴于此，miR-21可能是一种有前途的肺癌诊断和预后监测的无创标记物，但外周miR-21表达水平是否与肺癌病理分型有关目前尚无报道，且miR-21作用的分子机制尚不明确。因此，本研究拟通过生物信息学分析方法挖掘miR-21靶基因及其分子特征，然后采用实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescence quan⁃titative PCR，RT-qPCR）检测不同病理类型肺癌患者（小细胞肺癌、鳞状上皮细胞肺癌、腺癌）与健康对照人群血清的miR-21表达水平，进行ROC（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线分析，以丰富miR-21与肺癌关联的分子机制、探讨血清miR-21对于肺癌诊断及病理分型的价值。

1 资料与方法

1.1 资料 收集中国人民解放军第二五一医院经病理检查确诊的肺癌患者静脉血标本61例（含小细胞肺癌21例，腺癌18例，鳞癌22例）及该院同期正常体检人群静脉血标本26例。人miR-21引物套装购自苏州吉玛基因股份有限公司；内参U6引物购自美国Invitrogen公司；Trizol、FastQuant RTKit、SuperRe⁃al PreMix Plus购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌miR-21靶基因的生物信息学挖掘与分析

1.2.1.1 肺癌miR-21靶基因挖掘 利用miRe⁃cords数 据 库（http：//c1.accurascience.com/miRe⁃cords/）［6］对人的miR-21进行靶基因预测。并用Pic⁃Tar、PITA、MirTarget2、RNAhybrid和TargertScanS等11个miRNA靶基因预测工具对miRecords预测结果进行验证，保证至少被2种不同算法预测的交集作为miR-21的靶基因。再使用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）［7］搜索获得肺癌的相关致病基因，将致病基因与miRecords得到的靶基因取交集得到肺癌miR-21靶基因集合。

1.2.1.2 肺癌miR-21及其靶基因染色体定位 利用UCSC数据库（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）［8］和MapGene2Chrom web v2在线分析工具（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）［9］对肺癌miR-21及靶基因进行染色体定位和可视化分析。

1.2.1.3 肺癌miR-21靶基因的功能注释和STRING互作分析 利用DAVID数据库（Visualiza⁃tion，Annotation and Integrated Analysis，https：//da⁃vid.ncifcrf.gov）［10］采用全新的模糊聚类算法，将肺癌miR-21靶基因关联到生物学功能注释上，找出最显著富集的生物学功能注释（P-value≤0.05和Count≥4 genes），有利于对肺癌进行关联性研究分析。联合使用STRING11.0在线分析工具（https：//stringdb.org/）［11］和Cytoscape 3.6.1软 件［12］构 建 肺 癌miR-21靶基因编码产物蛋白的互作网络，筛选出重要的中心节点蛋白。

1.2.2 肺癌血清miR-21表达水平检测和诊断肺癌效能评估

1.2.2.1 RT-qPCR Trizol法提取样本血清总RNA。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit进行逆转录反应。逆转录反应总体系为10µl，分别加入10×Fast RTBuffer 2µl、U6 Reverse Primer 2µl、RNase-Free ddH2O 3µl、microRNA-21 Stem Loop Primer 2µl和RT Enzyme 1µl（即用即溶）。RT-qP⁃CR每个样本做3个复孔，miRNA反应体系为20µl：2×Super Real Premix Plus 10µl（终浓度为1×）、miR-21 PCR Primer Set（包含上下游引物）0.8µl、RNase-Free ddH2O 8.2µl和cDNA模板1µl。内参基因U6的反应体系为20µl：2×Super Real Premix Plus 10µl（终浓度为1×）、U6 Forward Primer 0.6µl、U6 Re⁃verse Primer 0.6µl、RNase-Free ddH2O 7.8µl和cD⁃NA模板1µl。设置PCR反应模式，进行PCR扩增（反应模式：95℃，3 min；95℃，12 s；62℃，40 s；共40个循环）。记录各管Ct值，复孔间Ct值之差＞0.5，需重复实验。

1.2.2.2 数据处理 以U6为内参基因，加入待测血清，实现目标基因均一化处理。待测血清miR-21的相对表达量公式：RQ=2-∆∆Ct。RQ＜1，则肺癌患者血清中目的基因表达水平高于正常人群目的基因表达水平；反之，则肺癌患者血清中目的基因表达水平低于正常人群目的基因表达水平。∆Ct=CtTarget-CtReference（CtTarget代表待测样本目标基因Ct值均值；CtReference代表待测样本内参基因Ct值均值）。肺癌患者与正常人群血清目的基因表达水平变化比较公式：RQ=2-∆∆Ct；∆∆Ct=（CtTarget-CtReference）肺癌组-（CtTarget-CtReference）正常组。

1.3 统计学分析 对miR-21的相对表达水平（2-∆∆Ct）进行对数转换，转换后数据符合正态分布。数据以±s表示，采用SPSS19.0软件分析。统计方法为独立样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌miR-21靶基因 使用miRecords数据库得到至少被2种不同算法预测且经过实验验证的miR-21靶基因共计30个。利用GeneCards数据库获取肺癌相关致病基因共计22 367个，将此22 397个致病基因与上述30个miR-21靶基因做交集，发现30个miR-21靶基因均存在于肺癌发病相关基因集合中，由此筛选到肺癌miR-21靶基因共计30个，分别为：肿瘤抑制因子原肌球蛋白1（TPM1）、核因子IB（NFIB）、细胞程序性凋亡蛋白4（PDCD4）、ser⁃pin家族B成员5（SERPINB5）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）、细胞表面凋亡受体（FAS）、代谢调节信号分子C（FAM3C）、同源结构域相互作用蛋白激酶3（HIPK3）、跨膜γ羧基酸蛋白4（PRRG4）、肌动蛋白α2（ACTA2）、抗增殖因子2（BTG2）、2型骨形态发生蛋白受体（BMPR2）、雌激素家族1（SESN1）、白介素受体6（IL6R）、细胞因子信号传导抑制因子5（SOCS5）、糖皮质激素1（GLC⁃CI1）、凋亡肽酶激活因子1（APAF1）、溶质载体家族16成员10（SLC16A10）、血清/糖皮质激素调节激酶家族成员3（SGK3）、半胱氨酸胞外蛋白质2（RP2）、细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）、肌动蛋白结合蛋白2（CFL2）、富含半胱氨酸的胞外蛋白质（RECK）、金属肽酶抑制剂3（TIMP3）、甲硫腺苷磷酸化酶（MTAP）、SRY-box转录因子5（SOX5）、磷酸酶张力蛋白同源物（PTEN）、转移因子1（E2F1）、转化生长因子β受体2（TGFBR2）和细胞分裂周期25A（CDC25A），见图1。提示miR-21在肺癌的发生、发展过程中可能起重要作用。

图1 肺癌miR-21靶基因Fig.1 miR-21 target genesin lung cancer

2.2 染色体定位 利用UCSC数据库和Map⁃Gene2Chrom web v2在线分析工具对肺癌miR-21及其靶基因进行染色体定位和可视化分析，miR-21位于人类17q23.1染色体，具体位置为chr17：59，841，266-59，841，337，长度22 bp。肺癌miR-21靶基因在染色体分布如图2。

图2 肺癌miR-21及其靶基因染色体定位Fig.2 Chromosomal localization of miR-21 and its target genes in lung cancer

图3 肺癌miR-21靶基因功能注释图Fig.3 Functional annotation map of miR-21 target genes in lung cancer

2.3 靶基因功能注释和互作网络 利用DAVID数据库将肺癌miR-21靶基因关联到生物学功能注释上，最显著富集的生物学功能注释（P-value≤0.05和Count≥4 genes）见图3，包括：regulation of cell prolif⁃eration（细胞增殖调节，含SGK3，TGFBR2，BM⁃PR2，FAS4个基因）、protein phosphorylation（蛋白质磷酸化，含GK3，HIPK3，TGFBR2，CDK6 4个基因）、protein kinase binding（蛋白激酶结合，含E2F1，AC⁃TA2，PTEN，CDC25A 4个基因）、protein binding（蛋白 质 绑 定 功 能，含RECK，E2F1，SGK3，FAM3C，RP2，TGFBR2，BMPR2，SOX5，CDK6，IL6R，SOCS5，TPM1，SESN1，PDCD4，TIMP3，PTEN，CDC25A，CD⁃KN1A，BTG2，SERPINB5，CFL2，MTAP，FAS，APAF1共计24个基因）、negative regulation of cell prolifera⁃tion（细胞增殖负调控，含CDKN1A，BTG2，CDK6，PTEN 4个基因）、negative regulation of apoptotic pro⁃cess（细胞凋亡负调控，含CDKN1A，HIPK3，FAS，PTEN，PDCD4 5个基因）、extracellular exosome（胞外，含BTG2，ACTA2，SERPINB5，FAM3C，CFL2，RP2，MTAP，APAF1，FAS，TIMP3共计10个基因）、cytosol（细胞液，含SGK3，ACTA2，TGFBR2，CDK6，TPM1，PDCD4，PTEN，SESN1，CDC25A，CDKN1A，BTG2，MTAP，APAF1，FAS共计14个基因）、cyto⁃plasm（细胞质，含ACTA2，SERPINB5，HIPK3，RP2，BMPR2，MTAP，CDK6，FAS，GLCCI1，SOCS5，SESN1，PTEN，PDCD4，CDC25A共计14个基因）、ATP binding（ATP结合，含SGK3，ACTA2，HIPK3，TGFBR2，BMPR2，CDK6，APAF1 7个基因）、apoptot⁃ic process（细胞 凋亡过程，含HIPK3，TGFBR2，APAF1，FAS，PTEN，PDCD4 6个基因），miRNA-21靶基因主要分布在细胞外，参与细胞凋亡、细胞增殖的调控过程、具有与ATP和蛋白质结合的功能，miRNA-21靶基因的异常表达可能与癌症的发生密切相关。

图4 肺癌miR-21靶基因互作网络图Fig.4 Interaction network of miR-21 target genes in lung cancer

图5 血清miRNA-21表达水平和ROC曲线Fig.5 Expression level and ROC curves of miRNA-21 in serum

利用STRING11.0在线分析工具和Cytoscape 3.6.1软件构建了肺癌miR-21靶基因编码产物蛋白的互作网络，发现有24个靶基因，分别为PTEN，PDCD4，CDKN1A，TIMP3，SERPINB5，CDK6，RECK，TPM1，BTG2，CDC25A，E2F1，APAF1，ACTA2，TGF⁃BR2，FAS，SESN1，HIPK3，SGK3，PRRG4，GLCCI1，NFIB，FAM3C，CFL2和MTAP之间存在蛋白互作关系，其中PTEN、PDCD4和CDKN1A为关键的、重要的中心节点蛋白（图4）。

2.4 血清miR-21的表达与诊断价值评估 提取的总RNA OD260/OD280为1.8～2.1可用于进一步检测。miR-21及U6内参均能实现特异性扩增，溶解曲线为单峰，具有特异性，实验结果可靠。血清miR-21在肺癌患者血清中的表达水平远高于正常人群（图5A），差异有统计学意义（P＜0.001）；各型肺癌相比（图5B），腺癌患者血清miR-21的表达水平显著高于小细胞肺癌与鳞癌患者（P＜0.05），而后两者之间无差异（P＞0.05）。根据各型肺癌患者血清miR-21扩增数据，绘制受试者ROC曲线，直观反映其诊断价值。血清miR-21诊断肺癌（图5C）、小细胞肺癌（图5D）、非小细胞肺癌（图5E）、鳞状上皮细胞肺癌（图5F）、腺癌（图5G）的AUC分别为0.915、0.879、0.934、0.911、0.962，见表1。使用Medcalc软件，根据ROC曲线，获得血清miR-21诊断肺癌及不同病理类型肺癌的临界值、灵敏度和特异性（表2）。

表1 各型肺癌患者血清miR-21的诊断效能Tab.1 Diagnostic efficacy of serum miR-21 in patients with various types of lung cancer

表2 血清miR-21对于肺癌诊断及其病理分型的价值Tab.2 Value of serum miR-21 for diagnosis and pathological type of lung cancer

3 讨论

恶性肿瘤的诊断是现代医疗和精准医学的研究热点，引起广泛关注。实现无创早期准确诊断，能够明显延长患者生存期，并降低其死亡率。mi-RNAs通过与靶mRNA的3'端非翻译区结合，诱导靶mRNA降解或抑制其翻译，从转录后水平调控基因表达。自发现miR-Lin4至今，人类基因组中发现的miRNAs基因已达2 500个以上，在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程的调节中发挥重要作用［13］。

人类miR-21位于人类染色体17q23.1，其靶基因主要分布在1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、14、15、17、18、20、22和X染色体上，而在5、13、16、19、21和Y染色体上没有肺癌关联的miR-21靶基因。有研究表明miR-21的异常表达与实体肿瘤密切相关，可能通过下调肿瘤抑制因子原肌球蛋白1（TPM1）、骨形态发生蛋白（BMP）通路相关基因、TCF21-KISS1基因、p53基因、细胞程序性凋亡蛋白4（PDCD4）促进肿瘤细胞增殖，抵抗细胞分化凋亡，发挥癌基因功能［14-19］。本研究获得的miR-21靶基因中，APAF1、FAS、GLCCI1、IL6R、NFIB和SOX5与细胞凋亡、分化过程有关，miR-21可能通过调控这些基因抵抗细胞凋亡分化，引发癌变；BTG2、CDC25A、CDK6、CD⁃KN1A、E2F1、SGK3、TGFBR2和TIMP3作为细胞周期的监测点，控制细胞周期的正常过度，miR-21可通过调控这些基因促进细胞增殖；ACTA2、BMPR2、CFL2和TPM1参与肌丝肌球蛋白的合成，miR-21可通过调控这些基因进行微丝微管生成的调节，进而影响细胞分裂过程；FAM3C被鉴定为上皮-间质转化和转移进展的新型调节剂，可用于区分临床早期患者的预后［20］。有研究表明miR-21参与非小细胞肺癌上皮-间充质转化状态的自分泌和旁分泌回路［21］；HIPK3在癌症组织和细胞系中表达不同，在癌症细胞生长，转移和血管生成中起双重作用，可能是癌症治疗的潜在靶标［22］；MTAP具有肿瘤抑制活性，该基因编码一种在多胺代谢中起主要作用的酶，其在许多癌症中均缺乏［23］；PTEN是一种抑癌基因，通过负调节AKT/PKB信号传导途径起抑癌作用［24］，而miR-21可通过此途径诱导上皮-间充质转化起关键作用［25］；RECK基因编码的蛋白质是富含半胱氨酸的胞外蛋白质，其表达在许多肿瘤和各种癌基因转化的细胞中均被强烈抑制，RECK的过表达可通过影响相关蛋白的表达来促进p53信号通路的激活，进而抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭［26］；RP2是X连锁性视网膜色素变性的原因之一，多数X连锁RP患者的色素性视网膜炎GTPase调节剂或RP2基因均发生突变［27］；SERPINB5是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞质中的表达可用于预测p期IA肺腺癌患者的不良预后［28］；SESN1基因编码雌激素家族的成员，编码的蛋白通过激活AMP激活的蛋白激酶介导p53对细胞生长的抑制［29］；SLC16A10是质膜氨基酸转运蛋白家族的成员，在头颈癌中SLC16A10的表达量与预后存在明显正相关，该基因可能是一种肿瘤抑制基因［30］；SOCS5是细胞因子诱导的细胞因子信号传导的负调节因子，与过敏性支气管哮喘有关［31］。

DAVID富集通路结果显示，miR-21靶基因主要富集在“protein binding”通路上，蛋白质作为反式作用因子与DNA结合，可影响细胞增殖与细胞周期等生物学过程的发生，而肿瘤形成是细胞增殖与凋亡的调节和控制发生严重紊乱的结果［32-33］。

有研究发现，肺癌患者血清miR-21表达水平高于正常健康人群［34］；对于非小细胞肺癌的进展、转移与预后具有诊断价值，其表达水平降低可作为肺癌治疗效果的指标［35-36］，但尚未有miR-21表达水平针对肺癌病理分型检测的报道。

为了评价血清miR-21对于肺癌的诊断和分型的价值，本研究采用RT-qPCR方法，检测不同病理类型肺癌患者血清miR-21的表达水平，结果显示，肺癌患者总体血清miR-21表达水平远高于正常人群，差异有统计学意义（P＜0.001），与文献报道相同；且腺癌患者血清miR-21表达水平显著高于小细胞肺癌与鳞癌患者（P＜0.05），而小细胞肺癌与鳞癌两者之间无显著差异（P＞0.05），说明血清miR-21的表达与肺癌相关，且表达水平与肺癌的病理类型有关。

进一步利用ROC曲线评价血清miR-21的诊断效能，已知ROC曲线下面积（AUC）越大，其临床诊断效能越大，当AUC＜0.5时，无诊断价值；AUC＞0.9时具有高诊断价值。本实验结果显示，血清miR-21诊断效能良好：肺癌AUC为0.915；小细胞肺癌为0.879；非小细胞肺癌为0.934，肺鳞癌为0.911，腺癌为0.963。结果揭示，血清miR-21对于各种类型肺癌均具有较好的诊断价值；针对病理分型，血清miR-21对于非小细胞肺癌的诊断优于小细胞肺癌，特别是对于腺癌具有最高的诊断价值，可能是作为AC早期诊断的高度敏感，稳定和可重复的生物标记。

与临床传统肿瘤标志物相比，目前，临床上诊断小细胞肺癌推荐首选胃泌素释放肽前体（ProGRP），ProGRP诊断小细胞肺癌AUC为0.921，临界值为65.66 ng/L，灵敏度和特异性分别为90.90%和89.90%，对于小细胞肺癌的诊断，该指标优于血清miR-21，但是ProGRP不适合非小细胞肺癌的诊断［37］。肺鳞癌诊断推荐首选细胞角质蛋白19片段（CYFRA21-1）和鳞癌抗原（SCC-Ag）；腺癌则以癌胚抗原（CEA）和糖类抗原125（CA-125）为首选。魏晟潇等［38］研究揭示，CEA和CA-125诊断非小细胞肺癌的AUC分别为0.839和0.843，其灵敏度分别为44.70%和59.30%，特异性分别为95.30%和90.40%。而血清miR-21诊断非小细胞肺癌的AUC为0.934、灵敏度为92.31%、特异性为80.00%，对比可知，对于非小细胞肺癌的诊断，血清miR-21优于CEA和CA-125。李沫等［39］研究揭示，CYFRA21-1、SCC-Ag和CEA对于肺癌诊断的AUC分别为0.710、0.403和0.667；灵敏度分别为70.50%、23.00%和52.50%；特异性分别为66.00%、69.80%和71.70%；CYFRA21-1和SCC-Ag诊断肺鳞癌的灵敏度分别为83.30%和46.70%；CEA诊断腺癌的灵敏度为63.00%；CYFRA21-1诊断肺鳞癌的灵敏度高于其他类型肺癌，CEA诊断腺癌的灵敏度高于其他类型肺癌，而血清miR-21诊断肺鳞癌的AUC、灵敏度和特异性分别为0.911、69.23%和100.00%，优于CYFRA21-1，血清miR-21诊断腺癌的AUC、灵敏度和特异性分别为0.963、92.31%和88.89%，优于CEA。

综上，miRNA-21靶基因主要分布在细胞外，参与细胞凋亡、细胞增殖的调控过程、具有与ATP和蛋白质结合的功能，miRNA-21靶基因的异常表达可能与癌症的发生密切相关。肺癌患者血清miR-21表达水平显著高于正常人群；不同病理类型肺癌相比，肺腺癌患者血清miR-21表达水平显著高于小细胞肺癌与肺鳞癌患者。血清miR-21表达水平的测定能够辅助肺癌诊断，且有望用于腺癌的鉴别和病理分型，但尚无法区分小细胞肺癌与肺鳞癌。血清miR-21作为诊断肺癌的潜在肿瘤标志物，具有广泛应用前景，一旦其检测方法和参考区间得以明确，并与传统肺癌肿瘤标志物进行联合检测，将显著提高肺癌诊断效率，改善患者治愈率与生存期，临床价值不容小觑。