IL-27在RA中的作用机制分析①

滑雅娜 朱凌妍 白 力 王永福

（包头医学院第一附属医院风湿免疫科（包头医学院风湿免疫研究所），包头014010）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节慢性炎症为特征的全身系统性疾病，可导致软骨和骨损伤，甚至残疾［1］。尽管目前多数RA患者的治疗效果比较乐观，但仍有患者病情未得到有效控制。因此，急需进一步阐明RA的发病机制，以开发新的治疗方案。研究发现，IL-27在自身免疫性疾病中具有免疫抑制作用，但对RA的作用尚未明确［2］。课题组前期临床研究发现，RA患者血清IL-27水平明显高于骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者，且血清IL-27水平与RA疾病活动性呈显著负相关。因此，本研究通过构建小鼠胶原诱导型关节炎（col⁃lagen-induced arthritis，CIA）模型，探究IL-27在RA疾病进展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性DBA/1小鼠（8周龄，SPF级，中国南京生物医学研究所）；小鼠rIL-27蛋白购自eBiosci⁃ence；Power UpTMSYBRTMGreen Master Mix购自美国Thermo Fisher Science；5X All-in-OneRTMaster Mix购自ABM；牛Ⅱ型胶原（CⅡ）和完全弗氏佐剂（CFA）购自Chondrex；核内因子染色试剂盒购自eBio-science；渗透缓冲液购自EBioscience；抗体均购自eBio-sci⁃ence；CantoⅡ流式细胞仪购自BD；Linegene9600系统购自杭州博日。

1.2 方法

1.2.1 造模及关节炎评估 牛Ⅱ型胶原充分混合于完全弗氏佐剂并乳化，分别间隔21 d，2次对DBA/1小鼠进行尾部皮下注射牛CⅡ型胶原（100µl/只），构建CIA小鼠模型。第2次免疫后约7 d可见小鼠足爪红肿，观察并评分直至实验结束。采用五级评分法对小鼠关节进行量化评分（AI）并观察，2次/周。评分标准：踝关节至整个脚掌肿胀记为4分；脚趾至踝关节肿胀记为3分；脚趾及脚趾关节肿胀记为2分；脚趾关节红斑或肿胀记为1分；正常记为0分，关节炎评分为四肢评分总和［3］。

1.2.2 IL-27干预及分组 小鼠随机分为3组：空白对照组（control）、CIA小鼠+同源IgG干预组（IgG）、CIA小鼠+IL-27干预组（IL-27干预组），空白对照组不做任何干预，IgG组与IL-27干预组每天腹腔注射等剂量（100µl/只）同源IgG或rIL-27蛋白（2µg），连续5 d，观察小鼠关节情况并评分。

1.2.3 流式细胞术检测Th17、Tr1和Treg比例 收集小鼠脾细胞，按核内因子染色试剂盒说明书进行操作，采用PMA/离子霉素混合物+BFA/莫能菌素混合物刺激5 h，脾细胞采用抗CD4和抗CD25染色，固定，细胞内固定和渗透缓冲液渗透，抗IL-17、抗IL-10和抗Foxp3染色，流式细胞仪收集数据并分析。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.4 ELISA检测小鼠血清炎症因子含量 实验结束时，心脏采血收集小鼠血液样本，静置30 min，离心（3 000 g，15 min），收集血清，-80℃保存备用，根据ELISA试剂盒说明书检测血清细胞因子水平。

1.2.5 RT-PCR检测小鼠关节内炎症因子IL-6、IL-17、IL-10或TGF-β基因表达 引物由Invitrogen公司合成，以Cyclophilin A为内参，序列见表1，Line⁃gene9600系统检测，相对量分析基因表达，所有实验至少重复3次。

1.2.6 组织病理学分析 实验结束时处死小鼠，解剖并留取小鼠后肢关节，石蜡包埋，切片（5µm），关节HE和番红O染色用于关节滑膜炎症和软骨损伤病理学观察。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism Version 8.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析和Kruskal-wallis检验，数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-27对小鼠CIA的改善作用 第2次免疫后开始至实验结束时，连续对CIA小鼠关节进行观察评分，结果显示，与IgG组相比，IL-27干预组小鼠关节炎评分显著降低，IL-27干预后CIA小鼠足爪肿胀程度明显减轻，且小鼠日常活动度较IgG阳性对照组明显增强（图1）。

图1 小鼠关节外形及关节炎评分（×100）Fig.1 Joint morphology and arthritisscoreof mice（×100）

2.2 IL-27对小鼠体内Th17细胞、Treg和Tr1细胞的影响 为更好地了解IL-27对RA的影响，采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏中CD4+IL-17+Th17细胞及CD4+IL-10+Tr1细胞百分比，结果显示，IgG组小鼠脾脏细胞中CD4+IL-17+Th17细胞比例明显高于空白对照组（P＜0.01），IL-27干预后小鼠脾细胞中CD4+IL-17+Th17细胞比例明显降低（P＜0.01）。IL-27干预组小鼠脾细胞中CD4+IL-10+Tr1细胞较IgG阳性对照组表达明显上调，3组小鼠脾细胞内CD4+FOXP3+Treg比例差异无统计学意义，表明IL-27干预缓解CIA小鼠病情与抑制Th17细胞表达而上调Tr1细胞表达有关，但并不依赖Treg的负免疫调控能力（图2）。

2.3 IL-27对血清细胞因子的调节作用 采用ELI⁃SA法及RT-PCR法检测小鼠体内炎症相关细胞因子表达结果显示，与空白对照组相比，IgG组的CIA小鼠血清IL-10、TGF-β、IL-6和IL-17A表达显著升高（P＜0.05，图3A），IL-27干预后IL-6、IL-17A表达明显降低，而IL-10表达明显上调（P＜0.05），与小鼠关节内相关炎症因子mRNA表达趋势一致（图3B）。此外，IL-27干预并未对Treg特征性细胞因子TGF-β表达产生影响。表明IL-27可能通过上调负调控细胞因子IL-10表达抑制CIA小鼠促炎因子表达，如IL-17、IL-6。

图2 各组小鼠体内Th17、Tr1和Treg比例Fig.2 Ratio of Th17，Tr1 and Treg in each group of mice

图3 小鼠血清及关节内IL-6、IL-17A、TGF-β和IL-10表达Fig.3 Expressions of IL-6，IL-17A，TGF-βand IL-10 in mouse serum and intra-articular

图4 各组小鼠关节组织病理形态改变（×100）Fig.4 Pathological changes of joint tissue of mice in each group（×100）

2.4 IL-27对CIA小鼠关节病理学状态的影响 关节受累是RA中最主要的临床症状，对此，本研究进一步观察IL-27干预对CIA小鼠关节骨与软骨的病理学状态的影响，HE染色（图4A）及番红O染色（图4B）结果显示，IgG阳性对照组较空白对照组小鼠关节滑膜细胞增生和软骨侵蚀更为严重，IL-27干预后CIA小鼠关节内炎症细胞浸润明显减轻，关节及软骨表面破坏较IgG阳性对照组明显减轻。

3 讨论

RA是最常见的自身免疫性疾病，其典型病理特征包括滑膜炎症和关节损伤，后期病情若得不到有效控制将严重影响患者生活质量［4］。因此，深入研究RA的发病机制，针对性预防和治疗RA，是当前风湿领域研究的热点及重点。

RA发病机制复杂，其治疗方案也多样化，目前药物虽可在一定程度上缓解大部分患者病情，但毒副作用较多，停药后易复发，急需开发新的治疗方案。机体免疫细胞和细胞因子相互作用，共同参与RA发生发展［5-8］。其中，部分具有负调节作用的免疫细胞及因子的作用效果不容忽视。IL-27作为IL-12家族新的细胞因子，随疾病种类、病情严重程度及机体所处应激状态差异，可通过促进Th1细胞增殖或抑制Th2、Th17细胞及Treg分化形式发挥促炎与抑炎双向效应［2，9-10］。近年研究发现，IL-27可通过负调控体内TNF-α或Th17细胞生成延缓AIDS疾病进展［11-12］。RA患者病变关节滑膜组织与滑膜液中也发现IL-27表达，但其潜在作用机制仍需进一步探究。此外，Tr1细胞作为体内具有免疫抑制作用的诱导Treg主要通过活化时所分泌的IL-10和TNFβ抑制T细胞反应，或分泌穿孔素B和颗粒酶及通过直接接触杀伤靶细胞，从而发挥负免疫调节功能［13-14］。研究报道，Tr1细胞参与诱导的多条应激信号通路激活可能与RA关节损伤和炎症发病机制相关。IL-27某些免疫调节功能发挥同样依赖Tr1细胞［12，15］。因此，为更好研究IL-27在RA中的作用机制，本研究进一步检测CIA小鼠体内Tr1细胞表达，结果发现，IL-27干预后CIA小鼠体内Tr1细胞比例明显提高，且小鼠体内IL-10含量也相应升高，表明IL-27可通过促进Tr1细胞及其相关抑炎因子IL-10生成进一步延缓CIA小鼠关节炎症进展。

本研究发现，注射给予小鼠牛CⅡ胶原免疫诱导后，其体内炎症因子，如Th17细胞、IL-17、IL-6等含量升高，且小鼠足爪关节红肿甚至变形，表明小鼠CIA模型构建成功。经IL-27干预后，CIA小鼠关节炎症状明显缓解，表现为小鼠关节红肿程度明显减轻，关节炎评分明显降低，且小鼠日常活动能力明显增强。进一步检测发现小鼠体内Th17细胞和IL-17表达明显下调，表明IL-27可通过抑制小鼠体内Th17细胞表达及其分泌的IL-17生成，进而缓解小鼠关节炎症进展。研究表明，活化的Th17细胞及其分泌的IL-17在关节滑膜中浸润是导致关节和软骨损伤的重要原因［16-17］。体内Th17细胞与Treg形成的Th17/Treg轴在生理状态下保持动态平衡，当机体发生病理性改变，Th17细胞增多或Tregs表达受抑制，导致Th17/Treg比例失衡，进而导致RA患者病情加重［18］。但本研究并未发现小鼠体内Treg及其特征性细胞因子TGF-β表达变化，因此推测IL-27的抗关节炎作用可能主要通过Th17相关途径发挥作用，而非依赖Tregs相关途径。与PICKENS等［19］在关于炎症性肠病研究中发现的，IL-27可上调IBD小鼠脾脏Treg表达结论不同，可能与该研究与本实验所选用疾病模型不同有关，因此，IL-27在缓解RA疾病进展中对Treg的具体作用有待进一步研究。

综上所述，本研究表明，IL-27可通过促进Tr1细胞及其相关抑炎因子IL-10表达，同时通过抑制Th17相关途径缓解CIA小鼠病情进展，为IL-27在RA及其他炎症性疾病治疗提供依据。