化妆品中金黄色葡萄球菌检测能力的验证方法与结果研究

时慧 宁晓文 闫爱莉

（丹东市疾病预防控制中心 辽宁丹东 118000）

1 前言

化妆品是人们生活中经常使用的物品， 常与人体皮肤紧密接触，如果化妆品中出现微生物，则会使化妆品受到污染，进而给人们的皮肤造成影响。近年来我国对化妆品质量的要求不断提升， 在检测过程中发现部分化妆品中含有较多的金黄色葡萄球菌，这一类微生物会给消费者的健康造成威胁。 因此必须要对化妆品中的金黄色葡萄球菌实施有效检测，以保证化妆品的安全性。

2 材料与方法

2.1 材料选择

2.1.1 培养基

SCDLP 液体培养基、Baird Parker 琼脂基础、金黄色葡萄球菌显色平板、BHI 肉汤； 血琼脂平板；甘露醇发酵培养基。

2.1.2 试剂

冻干兔血浆；卵黄亚蹄酸钾增菌液；对金黄色葡萄球菌实施检测的单重荧光PCR 检测试剂盒。

2.1.3 仪器

立式的压力蒸汽灭菌锅；生物安全柜；可以拥有电热和恒温保持功能的培养基培养箱；离心机；可以进行PCR 检测的实时荧光定量PCR 仪； 型号为DM500 的显微镜；德国所生产的漩涡混合器[1]。

2.1.4 样本选择

选择接受NIFDC-PT-188 化妆品能力验证的化妆品样本，样品的颜色为白色，样品的状态为球状，将样品放置在西林瓶的内部， 要求在瓶底中含有一定量的粉底膏，并且要求真空状态。

2.1.5 菌种

金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌。

2.2 方法

2.2.1 对样品实施前处理

将样品放置在生物安全柜中， 并在柜子的内部将样品打开，保证处于无菌操作的状态，并向装有2个样品的瓶中加入SCDLP 液体式的培养基，加入量为6 ml。 将样本进行摇晃， 使其可以呈现均匀的状态，并以分散式的形式存在。此次样品中含有较多的水分，具体的状态为块状，并且较为粘稠，不容易溶解。将样品置于灭菌试管的内部，使用液体式的培养基对西林瓶实施润洗操作， 同时取出金黄色葡萄球菌液体，放在培养基中作为阳性的对照组，另一组单独取培养基作为阴性对照组[2]。

2.2.2 使用国标法进行检测

将所形成的对照组别以及样本液体放置在36℃的环境下，保持1 d，达到增菌培养的效果。之后进行分离培养，主要包括初步分离以及分纯培养，前者需要将其放置在平板以及显色平板的上方， 置于36℃环境下平板培养2 d，显色平板培养1 d。最后进行鉴定试验，主要包括3 种检验方式，分别为染色镜检鉴定、甘露醇发酵试验鉴定、血浆凝固酶试验。

2.2.3 使用实时荧光 PCR 法进行检测

选择100 μl 量的增菌培养液，将其放置到无菌离心管的内部，将离心的速度设置为8 000 r/min，持续离心3 min，尽可能将清液吸取上来，同时加入50 μl 的DNA 抽提液，将两者混合之后将其放置于100℃的环境下保持10 min 的恒温状态， 之后进行离心，离心速度为13 000 r/min，持续离心3 min。离心之后对清液进行提取。之后准备空白、阴性和阳性的对照以及2 个样本，每一种的量都为5 μl，将盖子盖好，并将其放入到检测仪器的内部。

3 结果分析

3.1 国标法检测结果

在显色平板上所体现的结果虽然可以对两种菌落进行分析，但是由于其生长状态为交叉性，难以准确选择出具有可疑性的菌落， 为了提升挑选的菌落具有代表性， 之后在显色平板的上方进行了再次分离， 将具有代表性的菌落放在血琼脂平板上进行纯化培养， 最终使得菌落的颜色和形态处于基本一致的状态[3]。

国标法检测后2 个样品均呈现出浑浊的状态，分离培养结果相同。 在Baird Parker 平板之中显示为2 种不同分菌落形态，菌落均呈现为呈圆形，且表面均较为光滑，拥有凸起的位置，颜色均属于黑色，但是其中一个菌落的周围出现了浑浊带， 在外层出现了透明圈。在显色平板上方出现2 种菌落形态：菌落均呈现为呈圆形，且表面均较为光滑，拥有凸起的位置，但是颜色一个为蓝色，一个为粉紫色。 在血琼脂平板上菌落为金黄色，属于圆形，表面光滑但是不透明，在菌落的周围有溶血圈出现。阳性对照组也属于浑浊的状态，在Baird Parker 平板之中菌落为呈圆形，且表面均较为光滑，拥有凸起的位置，颜色均属于黑色，菌落的周围出现了浑浊带，在外层出现了透明圈。在显色平板上方菌落呈现为呈圆形，且表面均较为光滑，拥有凸起的位置，粉紫色。 在血琼脂平板上分离培养结果与2 个样品相同。 阴性对照组属于澄清的状态，具体结果见表1。

表1 培养结果

3.2 实时荧光PCR 法检测结果

Ct 值见表2，检测结果扩增曲线见图1。 经过检测之后，没有发现空白和阴性的对照组产生了FAM荧光信号，但是在阳性对照的检测过程中发现了这一信号，并且检测结果呈现为扩增的状态，曲线形态为“S”型，Ct 值在 16.97 之下，代表此次实验结果具有有效性。 在2 份检测样品中均检测出了信号，并且其信号样式与阳性对照组相同，2 组样品的Ct值分别为17.5 以及 21.19，2 个样品Ct 值都在35 之下，这代表在此次研究过程中在2 个样品内均检测出了金黄色葡萄球菌，和国标法检测样品的结果属于一致状态。

表2 检测样品Ct 值

图1 扩增曲线

4 讨论

在本次研究中出现了假阳性的问题， 大概率是由于在检验过程中没有按照相关的规范进行实验操作，环境也有可能存在一定的问题，导致交叉污染问题的出现。 假阴性结果出现的主要原因为培养基没有达到原有的质量标准和要求， 在分离鉴定过程中所使用的方法较为单一，以及检验人员没有充分、熟练地掌握操作技术等问题。 此次2 种检测方法均具有不同的优势以及劣势，例如PCR 法所需要使用的检测时间短，检测准确度高，但是容易受到外界各种因素的影响，对于检测人员的技能要求较高。