脓毒症患者外周血Th1/Th2和Th17/Treg平衡变化及临床意义

王建峰，杨楠楠

(焦作市第二人民医院重症医学科，河南 焦作 454000)

CD4+T细胞具有较高异质性，根据其分泌细胞因子和不同功能可分为Th1、Th2、Th17、调节性T细胞(Treg)等亚群，在功能及分化中，Th1/Th2和Th17/Treg是2对互相拮抗的体系，在维持机体免疫平衡中具有主要作用，若出现失衡，则会引起免疫功能异常，发生免疫性、肿瘤、炎症等疾病[1]。有研究证实[2]，Th1/Th2和Th17/Treg的平衡变化与肺癌、肝细胞癌、肾癌等癌症的发生、发展、预后有密切关系，其能预示癌症的进展。随着社会经济的发展，交通越来越发达，也显著增加了交通事故发生率，研究显示[3]，严重创伤后，机体常出现全身炎症反应及免疫紊乱，是导致患继发感染及脓毒症的主要原因。但目前尚没有研究报道Th1/Th2和Th17/Treg平衡变化与脓毒症的关系，基于此本研究报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2017年1月至2019年1月收治的68例多发伤患者，根据是否出现脓毒症分为2组，无脓毒症组43例，其中男33例，女10例；年龄17～68岁，平均(35.54±2.64)岁；受伤原因：2例殴击，4例挤压，6例锐器刺入，7例高处坠落，24例交通事故；创伤严重程度(injury severe score，ISS)评分17～47分，平均(35.54±2.64)分。脓毒症组25例，其中男19例，女6例；年龄18～67岁，平均(35.71±2.25)岁；受伤原因：1例殴击，2例挤压，3例锐器刺入，4例高处坠落，15例交通事故；ISS评分16～50分，平均(36.66±2.72)分。纳入标准：(1)脓毒症诊断符合《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)》[4]中相关标准；(2)受伤前1个月内无感染性疾病者；(3)患者及家属均知情研究；(4)受伤指入院时间<24 h；(5)ISS评分≥16分。排除标准：(1)妊娠及哺乳期妇女；(2)长期使用糖皮质激素者；(3)慢性疾病者；(4)免疫性疾病者；(5)年龄<14岁者。另选取同时期来我院体检健康者50例为对照组，其中男39例，女11例；年龄18～65岁，平均(35.28±2.39)岁；3组研究对象年龄、性别构成及两组患者ISS评分无差异(P>0.05)。本研究经伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 指标检测

主要试剂：PE anti-human IL-17A、647 anti-human FOXP3、PE/Cy5 anti-human CD25、FITC anti- human CD4，以上抗体及同型抗体均由美国BD公司提供。收集所有研究对象入院后24 h内9 mL外周血，分为3份，各3 mL。第1份促凝：3000 r/min离心10 min，取上清液，置于-80 ℃环境下待检，采用酶联免疫法(ELISA)检测血清IFN-γ、转化生长因子β(TCF-β)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)水平，试剂盒均由艾美捷科技有限公司提供，所有操作严格试剂盒说明书进行；第2份给予肝素锂抗凝：淋巴细胞分离后，采用实时荧光定量(RT-PCR)检测CD4+、CD25+Foxp3+Treg转录因子Foxp3和Thl7转录因子RORγr mRNA水平，Trizol一步法提取总RNA，根据试剂盒说明书反转录cDNA，RT-PCR检测RORγr、Foxp3 mRNA水平，人Foxp3上、下游引物：5’-TGACCAAGGCTTCATCTGTG-3’、5’-GAGGA ACTCTGGGAATGTGC-3’，扩增片段长度：179 bp；人RORγr上、下游引物：5’-CCTGGGCTCCTCCCCTCACC-3’、5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTFGCC-3’，扩增片段长度：170 bp；人β-actin上、下游引物：5’-AGCGAGCATCCCCCA AAGTT-3’、5’-GGGCACGA AGGCTCATCATF-3’，扩增片段长度：284 bp；引物均东莞太力生物工程有限公司合成；第3份肝素锂抗凝：淋巴细胞分离后，采用流式细胞术(ECM)检测CD4+、CD25+、Th1、Th2、Th17、Treg数量及比值，所有试验步骤均根据说明书和Carrier Y等试验进行，使用BD FACSDiva软件进行分析。

1.2.2 病情严重程度评价

脓毒症患者入院后使用脓毒症相关序贯器官衰竭评估(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)病情严重程度，包括呼吸、血液、肝脏、循环、神经、肾脏6个项目，总分值0～44分，得分越高病情越严重。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 3组外周血Th1、Th2、Th17、Treg数量及比值对比

脓毒症组外周血Th2、Th17、Treg、Th17/Treg比值明显高于无脓毒症组和对照组，Th1和Th1/Th2比值明显低于无脓毒症组和对照组(P<0.05)；无脓毒症组外周血Th2、Treg、Th17/Treg比值明显高于对照组，Th1和Th1/Th2比值明显低于对照组(P<0.05)，Th17与对照组对比无差异(P>0.05)，见表1。

表1 3组外周血Th1、Th2、Th17、Treg数量及比值对比

2.2 3组外周血相关因子mRNA水平对比

脓毒症组Foxp3和RORγr mRNA水平明显高于无脓毒症组和对照组，无脓毒症组Foxp3和RORγr mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 3组外周血相关因子mRNA水平对比

2.3 3组外周血Th1/Th2和Th17/Treg细胞因子含量对比

脓毒症组外周血IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23水平明显高于无脓毒症组和对照组，IFN-γ水平明显低于无脓毒症组和对照组(P<0.05)；无脓毒症组IL-6、IL-10水平明显高于对照组，IFN-γ水平明显低于对照组(P<0.05)；脓毒症组与无脓毒症组TCF-β水平对比无差异(P>0.05)，均明显高于对照组(P<0.05)；无脓毒症组与对照组IL-4、IL-17、IL-23水平对比无差异(P>0.05)，见表3。

表3 3组外周血Th1/Th2和Th17/Treg细胞因子含量对比

2.4 脓毒症组SOFA评分与外周血Th1、Th2、Th17、Treg数量的相关性

脓毒症组SOFA评分为(12.76±2.89)分，Pearson相关性分析显示，脓毒症组SOFA评分与外周血Th1呈负相关，与Th2、Th17、Treg呈正相关(P<0.05)，见表4。

表4 脓毒症组SOFA评分与外周血Th1、Th2、Th17、Treg数量的相关性

3 讨 论

CD4+T细胞为人体免疫系统重要细胞，在不同细胞因子作用下，Th细胞前体(Th0)可分化为不同细胞亚群，包括Th1、Th2、Th17、Treg等，最早由李呼伦教授于2009年提出Th1/Th2和Th17/Treg细胞亚群功能失衡，且随着研究的深入，大量试验证实，各亚群可分泌具备各自功能的细胞因子，并能互相进行影响制约[5]。研究表明[6]，Th1细胞可分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2等细胞因子，介导并激活巨噬和细胞毒性T细胞，对B细胞功能进行抑制。Th2细胞可分泌IL-4、IL-10等多种细胞因子，研究显示[7]，其能激活B细胞，并分化产生抗体，介导体液免疫反应。钟兴明等[8]在多囊卵巢综合征患者研究中发现，患者存在Th1细胞因子IL-2、IFN-γ低表达，Th2细胞因子IL-6、IL-10高表达，导致Th1向Th2飘移，抑制细胞免疫。Tong等[9]研究也证实，Th1细胞诱导免疫应答可对肿瘤增生进行抑制，因此若Th2细胞过度表达，使Th1处于劣势，则会抑制细胞免疫功能，导致肿瘤进一步发展。结果显示，脓毒症组外周血Th2明显高于无脓毒症组和对照组，Th1、Th1/Th2明显低于无脓毒症组和对照组，无脓毒症组外周血Th2明显高于对照组，Th1和Th1/Th2比值明显低于对照组(P<0.05)，说明Th1和Th2参与了炎症反应，且结果显示，脓毒症组外周血IL-4、IL-6、IL-10水平明显高于无脓毒症组和对照组，IFN-γ水平明显低于无脓毒症组和对照组，无脓毒症组IL-6、IL-10水平明显高于对照组，IFN-γ水平明显低于对照组(P<0.05)；脓毒症组与无脓毒症组TCF-β水平对比无差异，均明显高于对照组(P<0.05)；无脓毒症组与对照组IL-4水平对比无差异(P>0.05)，说明脓毒症组和无脓毒症组均存在Th1向Th2漂移的现象，且脓毒症组表现明显，由此提示脓毒症和引起强烈免疫抑制。

Treg具有免疫无能性和免疫抑制性特征，在机体免疫维持中扮演重要角色，其中Foxp3为控制Treg细胞功能和分化的重要基因，可通过释放TGF-β、IL-10等细胞因子抑制自身反应性T细胞增殖活化，以维持自身免疫耐受[10-11]。Th17主要功能为募集活化中性粒细胞，可分泌TNF-α、IL-17等细胞因子，在多种炎症反应和免疫性疾病中发挥重要作用，与Treg细胞分化间呈相互影响，功能上相互拮抗，共同维持机体免疫状态，使机体处于免疫平衡状态[12-13]。研究显示，脓毒症发生后机体处于代偿性防疫状态，即Treg与Th17细胞百分比均有所提升，但以Treg细胞为主，随着病情加重，机体又会处于免疫抑制状态，也会同时增加Treg与Th17细胞百分比，但主要以Th17细胞为主，均提示脓毒症患者Th17/Treg处于失衡状态[14]。结果显示，脓毒症组外周血Th17、Treg、Th17/Treg比值、IL-17水平、Foxp3和RORγr mRNA水平明显高于无脓毒症组和对照组，无脓毒症组外周血Treg、Th17/Treg比值、Foxp3和RORγr mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)，无脓毒症组与对照组IL-17水平对比无差异(P>0.05)，说明Th17和Treg也参与了炎症反应。IL-23为维持Th17功能重要细胞因子，当缺乏IL-23参与，则会显著降低IL-17水平[15]。结果显示，脓毒症组外周血IL-23水平明显高于无脓毒症组和对照组(P<0.05)，进一步证实Th17参与了炎症反应，且存在Th17/Treg比值失衡，随着病情的进展，其失衡进一步加强。SOFA评分是评估脓毒症患者病情严重程度和预后常用评分，结果显示，脓毒症组SOFA评分与外周血Th1呈负相关，与Th2、Th17、Treg呈正相关(P<0.05)，说明脓毒症患者Th1/Th2和Th17/Treg比值失衡还能反映病情进展和预后，可能作为患者脓毒症发生和预后预测指标。

综上所述，脓毒症患者外周血存在明显Th1/Th2和Th17/Treg比值失衡，与脓毒症发生及发展有密切关系。