苏氏伤痛宁软膏质量控制研究＊

刘 栋，段立鸣，郝 哲，张建帮，屈 俊，王丽军，李明春

苏氏伤痛宁软膏（曾用名：苏氏伤复宁软膏）是由当归、黄连、三七、冰片等九味药材加工制成的中药非标准制剂，具有活血化瘀、消炎镇痛、去腐生肌之功效，适用于灼烫伤创面、久治不愈性溃疡性创面、蜂窝组织炎、带状疱疹等［1］病症，疗效确切。

该制剂已在临床使用三十多年，其质量标准制定年代久远，只有软膏常规检验项目，不能全面控制其质量。 为了“提高药品标准和药品质量”［2-4］，该研究采用薄层色谱法 （thin layer chromatography，TLC）定性鉴别黄连、当归、冰片三味药材，并采用高效液相色谱法（high performance liquid hromatography，HPLC）测定黄连中的有效成分盐酸小檗碱的含量，以期为制剂标准的提高提供参考。 现将研究结果报告如下。

1 仪器与材料

LC-10A 型高效液相色谱仪（SPD-10A 紫外检测器、手动进样器、LCsolutionLite 色谱工作站，日本Shimadzu 公司）；pHS-3C 型酸度计（上海雷磁仪器厂）；BT125D 型十万分之一电子分析天平 （赛多利斯有限公司）；ZF-2 型紫外仪 （上海安亭仪器厂）；电热恒温水浴锅（华北实验仪器公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）；层析用硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司）。

对照品：盐酸小檗碱（批号为110713-201613）、冰片（批号为111688-201603），对照药材：黄连（批号 为120913-201310）、 当 归 （批 号 为120927-201315）购自中国食品药品检定研究院，均为检验鉴定合格品； 苏氏伤痛宁软膏 （批号：180509、180516、180523） 和阴性样品均为解放军第988 医院自制；色谱乙腈（天津四友），超纯水为重蒸法自制。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 黄连［5］供试 品溶液：取本 品5 g，加乙醇30 ml，加热回流1 h，在冰浴中冷却20 min，取出，滤过，回收溶剂至干，再用2 ml 甲醇溶解，取上层溶液即得。 对照药材溶液： 取黄连对照药材0.5 g，加10 ml 甲醇后超声提取30 min，放冷，过滤，取滤液即得。 对照品溶液：称取盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇溶解成0.5 mg/ml 的溶液， 即得。 阴性对照溶液：取缺黄连的阴性样品，同供试品溶液制备方法，即得。 按中国药典四部通则0502 项下方法试验［6］，对照药材溶液1 μl、对照品溶液1 μl、供试品溶液3 μl、阴性对照溶液3 μl 分别点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2），展开后晾干，在紫外灯的365 nm 波长下检视。 结果显示：在供试品色谱中，在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上均有相同颜色的荧光斑点，并且阴性对照无干扰，见图1。

图1 黄连TLC 图

2.1.2 当归和冰片［7］供试品溶液：取“2.1.1”项下供试品溶液即得。 对照药材溶液：取当归对照药材0.5 g，用25 ml 甲醇超声提取30 min，放冷后过滤，滤液蒸至2 ml，取上层溶液即得。 对照品溶液：取冰片对照品适量， 用甲醇溶解成3 mg/ml 的溶液，即得。 阴性对照溶液：缺当归的阴性样品、缺冰片的阴性样品均取5 g，同供试品溶液制备方法，即得。 按中国药典四部通则0502 项下方法试验［6］，上述五种溶液各2 μl 分别点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为环己烷-乙酸乙酯（9∶1），展开后晾干，先在紫外灯365 nm 波长下检视，结果显示：在供试品色谱中，与当归对照药材色谱相应的位置上，可见相同颜色的荧光斑点，并且缺当归阴性对照无干扰；再喷显色剂：5%香草醛硫酸-乙醇溶液（1∶4）适量，缓慢加热至105 ℃，烘至斑点显色清晰，在日光下检视，结果显示：在供试品色谱中，与冰片对照品色谱相应的位置上，可见相同颜色的斑点，并且缺冰片阴性对照无干扰。 结果见图2。

图2 当归和冰片TLC 图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH 值至3.0）（30∶70）；检测波长349 nm；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；进样量10 μl。

2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品，用甲醇溶解制得每1 ml 含20.34 μg 的对照品贮备液；精密吸取2 ml 至10 ml 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，制得4.07 μg/ml 的对照品溶液。（2）供试品溶液：取该品约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚（60~90 ℃）15 ml，微热，振摇溶解，再加入盐酸-90%甲醇（1∶100）混合溶液15 ml，加热回流1 h，放冷，转移至分液漏斗中，静置分层后，分取盐酸-90%甲醇（1∶100）溶液层。 再用盐酸-90%甲醇（1∶100）混合溶液振摇提取2 次，15 ml/次，合并盐酸-90%甲醇（1∶100）溶液，用石油醚（60~90 ℃）洗涤2 次，15 ml/次，分取盐酸-90%甲醇（1∶100）溶液，回收溶剂至干，然后用甲醇将残渣溶解、转移至10 ml 量瓶中，再用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 （3）阴性对照溶液：取缺黄连阴性样品，同供试品溶液制备方法，即得。

2.2.3 专属性试验 取 “2.2.2” 项下三种溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样，记录色谱图。 见图3。 由图可知，苏氏伤痛宁软膏中的其他成分对盐酸小檗碱的含量测定无干扰。

图3 苏氏伤痛宁软膏HPLC 图

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品贮备液适量， 用甲醇稀释成一定浓度的对照品溶液。 精密吸取各溶液10 μl，分别进样测定。 以溶液浓度（C）为横坐标，相应的峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得到的回归方程为：A=42 670C+2 964（r=0.999 9）。 由此可知，盐酸小檗碱在1.02~10.17 μg/ml 范围内线性关系良好。

2.2.5 稳定性试验 供试品溶液制备好后分别于0、2、4、8、12、24 h 时各进样1 次，测定峰面积。结果样品中盐酸小檗碱峰面积的RSD 为1.07%，表明供试品溶液在配制24 h 内相对稳定。

2.2.6 精密度试验 在上述色谱条件下，将对照品溶液重复进样6 次。结果盐酸小檗碱6 次测定的峰面积RSD 为0.97%，表明所用仪器具有良好的精密度。

2.2.7 重复性试验 取苏氏伤痛宁软膏 （批号：180509）内容物适量，精密称取2.0 g，共6 份，按上述方法分别制备供试品溶液，然后进样测定并计算含量。结果样品中盐酸小檗碱的含量平均值为19.78 μg/g，RSD=1.01%。

2.2.8 加样回收率试验 称取“2.2.2”项下缺黄连的阴性对照样品6 份，每份约2.0 g，分别精密加入“2.2.2”项下对照品贮备液2.0 ml，然后按上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件测定，计算回收率，见表1。

2.2.9 样品含量测定 取苏氏伤痛宁软膏 （批号：180509、180516、180523）内容物适量，精密称定，按上述方法制备供试品溶液， 再分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μl，进样测定，并按外标法计算样品中盐酸小檗碱的含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

表2 样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 定性鉴别

3.1.1 黄连的TLC 鉴别 由于黄连中生物碱含量较高，该研究选择以盐酸小檗碱为代表成分进行薄层鉴别。 相对于超声提取来说，在回流状态下，软膏处于液态，有利于指标成分的提取。展开剂中加入冰醋酸，有利于改善斑点拖尾现象，也提高了分离度。3.1.2 当归和冰片的TLC 鉴别 两味药材的鉴别采用同一供试品溶液在同一薄层板、同一展开系统下展开、分离，然后在紫外灯下检出当归；喷显色剂后在日光下检出冰片。 方法操作简单，省时省力高效。

供试品溶液的制备采用乙醇回流提取，能保护环境、 维护操作者健康； 另外乙醇对基质溶解性差，而对指标成分提取率高，杂质干扰少，方法重现性好。

3.2 含量测定

3.2.1 指标成分的选择 由制备工艺可知，样品中极性小的成分含量较高，比如冰片中的龙脑、麝香中的麝香酮等，但这些成分需要在气相色谱条件下检测，而基层药检室往往没有配置气相色谱仪。 经过比较各药材中有效成分的含量，最终选用可在液相色谱条件下检测的盐酸小檗碱。 黄连中的盐酸小檗碱具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用［8］，适合作为苏氏伤痛宁软膏的含量测定指标成分。

3.2.2 供试品溶液制备方法的选择 尝试三种供试品溶液制备方法：（1）样品先经酸水提取，然后碱化水层，再用有机溶剂萃取小檗碱。 此方案制备的供试品溶液纯度高，干扰少，但是损失较大，提取率低。（2）用甲醇或甲醇-盐酸溶液的提取液检测［9］。结果，提取液中有一定量的油性基质（提取液蒸干后可见，冷冻后也不能固化），若注入液相色谱柱，难以洗脱干净。（3）该研究所用方法。盐酸小檗碱在盐酸-90%甲醇（1∶100） 溶液溶解度较大， 在石油醚（60~90 ℃）极微溶解，因而萃取率较高。

3.2.3 流动相的选择 尝试三种流动相体系：（1）乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（30∶70）［10］，盐酸小檗碱峰出现拖尾现象。 （2）乙腈-0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液（50∶50）（每100 ml 中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH 值为4.0）［11］，盐酸小檗碱峰分离度好，不拖尾，但流动相配制烦琐，且试剂相对较贵。 （3）该研究所用流动相，既不拖尾、分离度好，又配制方便，因而选择该条件。

3.2.4 检测波长的选择 取对照品溶液在200~400 nm 范围内扫描，结果显示在265 nm、345 nm 处有最大吸收。 但在265 nm 波长下干扰严重，345 nm波长下也有轻微干扰峰出现， 经调节流动相比例、流速等均不能解决，后将波长设为349 nm，则能消除干扰。

综上所述，采用以上方法快速简便，准确可靠，能很好地应用于苏氏伤痛宁软膏的质量控制。