园艺矿物油乳剂对亚洲柑橘木虱成虫刺吸行为的影响

黄振东, 蒲占湑, 胡秀荣, 陈国庆, 吕 佳, 朱 莉

(浙江省柑橘研究所, 浙江台州 318020)

柑橘黄龙病(huanglongbing)是目前世界上最具破坏性的柑橘病害。亚洲柑橘木虱Diaphorinacitri为刺吸式口器害虫，是柑橘黄龙病菌传播的媒介昆虫，在全球广泛分布，主要危害柑橘Citrusreticulata、橙Citrussinensis、柚Citrusmaxima、九里香Murrayapaniculata等芸香科(Rutaceae)植物，其通过在新梢、嫩芽和幼叶上吸食汁液进行为害。亚洲柑橘木虱可以携带黄龙病病原体，带菌亚洲柑橘木虱取食健康橘树时，病原体通过口针进入植株内，在植株内定居、繁殖，受害的植株叶片均匀黄化，脉间叶肉似缺锌状黄化，节间短，后期枝干枯死，果实小并畸形，根多腐烂，甚至全株枯死。因此，亚洲柑橘木虱的有效防治是切断柑橘黄龙病传播蔓延的重要途径(Xuetal., 1988; Pelz-Stelinskietal., 2010)。

为明确媒介昆虫传播植物病原的机理和昆虫在寄主植物上的定殖、发育行为和寄主适应性，需要研究其在寄主植物的取食机制。McLean和Kinsey在1964年开发了昆虫在植物组织中口针穿透和吸入活性的记录仪器(McLean and Kinsey, 1964)，可用于刺吸式口器昆虫的取食行为研究，该仪器将昆虫和植物建立电子回路，不同的刺吸行为会产生各种典型的电压波动(波形)，采用相应的技术定位其刺吸位置(组织学)或者摄取信号、排出或分泌唾液等，该技术称为刺吸电位技术(electrical penetration graph, EPG)。一般昆虫在刺吸过程中，会产生非常小的电势差，这种电势差通过信号放大器放大才能显示出来，昆虫从刺吸到取食过程的电势不同，会显示不同的波形，根据波形判断是在取食还是其他行为(李静静等, 2019)。大部分的植食性刺吸式口器昆虫都可以通过刺吸电位技术记录其刺吸行为，如木虱科、粉虱科、蚜虫科等。采用直流电系统根据亚洲柑橘木虱在植物软组织和表皮的刺吸路径相关DC-EPG信号分别定义了其主要的取食波形(Bonanietal., 2010; 杨成良等, 2011; 乌天宇等, 2020)。

以石油为原料的园艺矿物油(horticultural mineral oil, HMO)乳剂对亚洲柑橘木虱、柑橘潜叶蛾Phyllocnistiscitrella、二斑叶螨Tetranychusurticae、柑橘盾蚧类包括红圆蚧Aonidiellaaurantii、牡蛎蚧Lepidosaphesbeckii和柑橘粉虱Aleurocanthussp.均有良好的防治效果(Liuetal., 2002; Leongetal., 2012)。HMO价格比一些合成农药便宜，对橘园有益昆虫的毒性也低于合成农药，而且至今未见到对柑橘害虫的抗药性报道，该产品已经通过国际有机物资审查机构评审用于有机柑橘生产(Stansly and Tansey, 2015)。Rae等(1997)报道HMO对于亚洲柑橘木虱有一定的抑制效果，随着HMO浓度的提高，亚洲柑橘木虱在嫩叶上的产卵量和若虫数明显减少，显著低于喷水对照，其中卵存活率最高，其次为高龄若虫，而1-2龄若虫存活率最低。Yang等(2013)在0.5%～2%浓度HMO处理后发现亚洲柑橘木虱显著减少柑橘叶片上的刺吸行为。

为进一步明确HMO对亚洲柑橘木虱成虫刺吸行为的影响，探索采用HMO控制其田间种群和减轻柑橘黄龙病危害的理论依据，为下一步开展柑橘黄龙病和柑橘木虱的综合防控奠定基础，我们采用EPG技术开展不同浓度HMO对亚洲柑橘木虱成虫在柑橘上的刺吸取食行为影响的研究，并初步分析HMO控制亚洲柑橘木虱和柑橘黄龙病的作用机理。

1 材料与方法

1.1 供试植物和昆虫

健康真龙柚Citrusgrandiscv. Zhenlongyou种子，来自浙江省柑橘研究所的国家柑橘品种改良中心浙江分中心，种子去皮，播于蛭石中萌发，发芽2～3月(叶3～5片)后，挑选生长一致的植株用作亚洲柑橘木虱的寄主植物进行EPG测试，实验所用的HMO采用韩国SK农用喷淋油(绿颖，EnSpray 99，一种nC24矿物油，韩国SK公司生产)，在EPG实验开始前一天采用手持喷雾器对供试植株叶片正反面喷施至完全喷湿为止，并在实验室阴干1 d，用过的植株不再作为下一次实验材料。

实验所用亚洲柑橘木虱从浙江省台州市黄岩区头陀镇一处果园(28°38′35″N, 121°09′30″E)收集后饲养于浙江省柑橘研究所玻璃温室内，采用九里香罩笼饲养3年，实验前提前1 d将日龄在15 d左右的成虫移入EPG测试实验室内罩养虫笼的真龙柚植株上，用过的亚洲柑橘木虱不再作为下一次实验材料。EPG实验所用的银胶、铜钉、金丝购自上海应赛仪器设备有限公司。

1.2 实验处理

实验设HMO浓度0.25%, 0.5%, 1%和2% (v/v) 处理和清水对照，每处理4组重复，每重复分别随机记录15次单头亚洲柑橘木虱成虫在单株柑橘植株有效刺吸信号，剔除12 h测试结束前由于亚洲柑橘木虱成虫脱落而导致信号中断的无效信号。

1.3 EPG实验

EPG实验在一个专用房间进行，照明采用LED节能灯，光照强度300 lx、温度控制在26～28℃、相对湿度维持在65%～70%，测试从下午14∶00开始，共记录12 h，实验时段光周期维持14∶00-18∶00光期，18∶00-第2天2∶00暗期，采用Giga-8型刺探电位仪 (EPG系统， Laboratory of Entomology, Wageningen University, The Netherlands)，通过Giga-8型DC EPG放大器记录信号，信号放大倍数调整为100倍。

将饲养在实验室养虫笼内的亚洲柑橘木虱成虫取出饥饿2 h，置于冰箱中在0℃下冷冻3～5 min，迅速用导电性银胶将18 μm直径的金丝粘到亚洲柑橘木虱成虫背板中间，粘结结束后，静置3～5 min使其能正常活动后，转入法拉第笼中处理过的真龙柚植株上幼嫩并完全展开的叶片上，连接金丝到电极，植物电极则插入土壤，然后关上法拉第笼门，屏蔽外界干扰，开启EPG仪器和记录，一次同时进行8组相同HMO浓度处理的亚洲柑橘木虱成虫EPG信号记录。采用Stylet+d.exe Version 1.2软件接受信号，将12 h内完成有效刺吸的记录的EPG波形图像贮存，采用stylet+a.exe Version 1.2软件分析，参考Bonani等 (2010)方法，将亚洲柑橘木虱的EPG波形分为np波(非刺探波)，C波(路径波,即口针在表皮细胞组织内的移动和探寻活动和唾液分泌)，D波(为口针第一次接触韧皮部组织)，E1波(代表在韧皮部出现唾液分泌)，E2波(代表在韧皮部吸食汁液)，G波(代表在木质部吸食汁液)，分析波形后并将数据导入EPG_analysis work sheet_v4.4.1(Sarriaetal., 2009)统计每组有效刺吸信号参数的平均值。

1.4 数据分析

将各波形参数采用DPS14.5系统单因素方差分析和Tukey氏检验进行差异显著性分析，设定P=0.05。

2 结果

2.1 亚洲柑橘木虱成虫在HMO处理柑橘苗上的各种波形持续时间百分比

12 h内，对照组C波持续时间百分比为52.49%±3.52%，显著低于各浓度HMO处理组(P<0.05)，表明HMO处理后使得亚洲柑橘木虱成虫在柑橘叶片取食适应性下降。各浓度HMO处理E2波持续时间百分比为7.72%±1.83%至10.96%±4.26%，均显著低于对照组(27.73%±1.50%)(P<0.05)。对照组中跟韧皮部吸食行为有关的3个波形D+E1+E2持续时间的比例为29.35%±1.18%，显著高于各浓度HMO处理组(P<0.05)，表明叶面喷施HMO后显著减少了亚洲柑橘木虱在柑橘叶片韧皮部的取食(表1)。

表1 亚洲柑橘木虱成虫在HMO处理的柑橘(Citrus grandis)叶片上12 h内各种EPG波形持续时间百分比Table 1 Percentage of duration of various EPG waveforms of Diaphorina citri adults in response to depositsof HMO on the surfaces of citrus (Citrus grandis) leaves within 12 h

2.2 亚洲柑橘木虱成虫在HMO处理柑橘苗上的各种EPG特征信号分析

图1显示，喷洒不同浓度的HMO显著减少了亚洲柑橘木虱在柑橘叶片上的刺探次数，随着HMO浓度增加，刺探次数减少。 各浓度HMO处理组的平均刺探次数均显著少于清水对照组(P<0.05)，较高浓度的1%和2% HMO处理组刺探次数均显著少于0.25%和0.5%处理组(P<0.05)，但1%和2% HMO处理组间刺探次数差异不显著(P>0.05)。

图1 HMO处理对亚洲柑橘木虱成虫有效刺探次数的影响Fig. 1 Effect of HMO treatment on the number ofeffective probes of Diaphorina citri adultsHMO: 园艺矿物油Horticultural mineral oil (nC24). 图中数据为平均值±标准误；柱上不同小写字母表示差异具显著(P<0.05, Tukey氏检验)。图2和3同。Data in the figure are mean±SE. Different small letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Tukey’s test). The same for Figs. 2 and 3.

各浓度HMO处理对各波形次数影响的结果显示，清水对照组亚洲柑橘木虱的每成虫C波(图2: A)、D+E1波(图2: B)、E2波(图2: C)和G波(图2: D)次数均显著高于各浓度HMO处理组(P<0.05)。其中，C波(图2: A)、D+E1波(图2: B)和E2波(图2: C)均随着HMO浓度增加而减少。上述结果表明，喷施HMO可以显著减少亚洲柑橘木虱在柑橘植株韧皮部和木质部上的主动取食行为次数。

每成虫各波形累积时间(WDI)统计的结果显示(表2)，不同浓度HMO处理组亚洲柑橘木虱的C波WDI均大于清水对照组，但不同浓度HMO处理组间不存在显著性差异(P>0.05)，清水对照组的D波、E1波、E2波和G波WDI均显著大于各浓度HMO处理组(P<0.05)， 其中E1波WDI呈现出随着HMO浓度增加而显著减少的趋势(P<0.05)。

图2 HMO处理对亚洲柑橘木虱成虫各波形次数的影响Fig. 2 Effect of HMO treatment on the number of various waveform events of Diaphorina citri adults

表2 亚洲柑橘木虱成虫在HMO处理的柑橘(Citrus grandis)叶片上12 h内各波形持续时间平均值Table 2 The mean duration of various waveforms of Diaphorina citri adults in response to depositsof HMO sprays on the surfaces of citrus (Citrus grandis) leaves within 12 h

进一步统计每成虫各种波形单次持续时间(WDE)的结果显示，各浓度HMO处理组np波、D波和E2波WDE均低于清水对照组；2% HMO处理组D波、E1波和E2波WDE显著低于其他浓度的HMO处理组和清水对照组(P<0.05)。各浓度HMO处理组C波WDE均显著高于清水对照组(P<0.05)(表2)。

与清水对照比较，不同浓度HMO处理显著推迟了亚洲柑橘木虱成虫从口器接触叶片到第1次出现刺探的时间(图3: A)和成虫从口器接触叶片到第1次出现韧皮部刺探的时间(图3: B)。

图3 HMO处理对亚洲柑橘木虱成虫从口器接触叶片到出现第1次刺探时间(A)和从口器接触叶片到出现第1次韧皮部刺探时间(B)的影响Fig. 3 Effect of HMO treatment on the time from mouthpart contact with leaf to the first probe (A) and the time from mouthpart contact with leaf to the first phloem probe (B) of Diaphorina citri adults

3 讨论

化学农药防治亚洲柑橘木虱是控制柑橘黄龙病的主要手段之一，通常采取增加化学农药喷施次数和统一时间喷药方法对亚洲柑橘木虱进行防治，从而切断柑橘黄龙病的田间传播，但是多次使用化学合成农药会造成生态环境不利影响和果实化学农药残留风险(Raeetal., 1997; 余继华等, 2017)。美国佛罗里达州隔2周喷施一次低剂量HMO，3年的试验表明能显著降低亚洲柑橘木虱的成虫和若虫的虫口数量(Stansly and Tansey, 2015)，因此，安全环保的HMO具有应用于亚洲柑橘木虱防治的潜力。

通过亚洲柑橘木虱口针在不同植物组织内所对应的EPG波形特征，可以明确其取食行为和取食时长，Bonani等(2010)和杨成良等(2011)已经将亚洲柑橘木虱成虫在甜橙幼苗产生的EPG波形与相关唾液鞘末端通过植物组织相关性进行对应，定义了亚洲柑橘木虱取食行为的各种相关波形。在EPG波形基础上研究亚洲柑橘木虱寄主选择性、亚洲柑橘木虱传播黄龙病菌的机制、植物的抗虫机制，以及一些药剂对于亚洲柑橘木虱行为影响等行为生态学研究，已经成为亚洲柑橘木虱生理学研究的热点。朱红梅等(2010)通过EPG技术分析亚洲柑橘木虱在番石榴精油处理过的柑橘苗上取食行为变化，验证了番石榴精油对亚洲柑橘木虱种群抑制的机制，发现亚洲柑橘木虱在番石榴精油处理过的橘苗上相比于清水对照显著增加了木质部取食次数、非刺探时间、刺探定位时间、韧皮部分泌唾液时间，显著减少了取食时间和韧皮部取食时间。我们在实验中也发现HMO处理橘苗后亚洲柑橘木虱在12 h内的刺探次数明显减少(图1)，同时显著减少了取食时间和韧皮部取食时间(表1)。

目前HMO对昆虫的作用机制仍不明确，但前人推测其作用主要与以下因素有关：一是破坏昆虫身体的上表皮脂肪，二是掩蔽产卵的刺激剂，三是抑制寄主植物挥发性诱食剂的释放，四是直接对害虫驱避等(Liu and Beattie, 2002; Poerwantoetal., 2012; Mirandaetal., 2014)。柑橘幼嫩组织或许分泌出一种独特的挥发物从而引诱亚洲柑橘木虱成虫取食，Ouyang等(2013)推测HMO可能是进入植物气孔阻止植物挥发性物质的释放，因抑制或掩盖柑橘叶片表面的挥发性物质而减少了亚洲柑橘木虱在寄主上定殖。我们根据亚洲柑橘木虱在喷施不同浓度HMO和喷施清水的柑橘叶片上的取食行为变化，发现跟韧皮部取食行为有关的3个波形D+E1+E2持续时间的百分比清水对照显著高于HMO处理(表1)，说明使用HMO显著减少亚洲柑橘木虱在柑橘叶片韧皮部取食时间和取食次数；也发现HMO处理明显推迟第1次刺探时间和第1次韧皮部刺探开始时间(图3)，与Yang等(2013)报道的亚洲柑橘木虱成虫的取食活动明显受HMO在叶面的残留影响，取食活动随HMO的浓度升高而明显降低等结果类似。Yang等(2013)同时发现HMO使用浓度与刺探次数呈指数负相关，随着HMO使用浓度提高，刺探次数呈指数减少，HMO在高于0.5%浓度以上影响幅度较小。我们也发现1%与2% HMO对亚洲柑橘木虱的刺探次数的影响没有显著差异(图1)，初步推测HMO的作用机制可能是其进入植物气孔阻止植物挥发性物质的释放，从而抑制或掩盖柑橘叶片表面的挥发性物质，减少了亚洲柑橘木虱在寄主上取食诱导，因此可能在一定的HMO使用浓度阈值下，就能减少柑橘叶片上的植物挥发性物质的释放。

Wu等(2016)提出带黄龙病菌的亚洲柑橘木虱在韧皮部出现唾液分泌过程中容易传播柑橘黄龙病。我们在实验中发现，亚洲柑橘木虱12 h内在HMO处理过的橘苗上取食，E1波累积时间随HMO浓度增加而显著缩短，而且显著低于清水对照，2% HMO处理E1波累积时间比清水对照减少约17倍(表2)，因此高浓度的HMO可以显著降低柑橘黄龙病的传播几率。E2波为吸食汁液过程，E2波累积时间的长短是判断植物适合度的重要指标, 直接反映亚洲柑橘木虱在寄主取食生存。Luo等(2016)进行了亚洲柑橘木虱在带柑橘黄龙病菌橘苗上的获菌试验，24头有E2波形的柑橘木虱中23头获得了柑橘黄龙病菌，说明韧皮部吸食到汁液过程直接影响黄龙病菌的获取。本实验结果显示各浓度HMO处理E2波持续时间百分比显著低于清水对照(表1)，E2波累积时间、E2波单次持续时间、E2波次数均显著低于清水对照(图2; 表2)，表明HMO显著影响亚洲柑橘木虱在柑橘上的取食行为，改变了亚洲柑橘木虱寄主的适应度，降低了柑橘木虱在黄龙病树上的获菌几率。这可能是我们在国内一些多年连续使用HMO的橘园发现柑橘黄龙病发生率和亚洲柑橘木虱虫口密度相对较低的原因。

本研究通过EPG技术进一步揭示了HMO对亚洲柑橘木虱的控制作用，表明柑橘喷施HMO后亚洲柑橘木虱显著减少取食次数和有效取食时间，降低了亚洲柑橘木虱寄主适应性，同时还显著减少了其在韧皮部的分泌唾液时间，从而降低黄龙病传播的几率，因此在柑橘黄龙病和亚洲柑橘木虱的综合防治体系中，HMO是一种值得推荐的产品。根据HMO浓度与取食行为不存在线性相关结果，初步推断HMO的作用机制可能是其进入植物气孔阻止植物挥发性物质的释放，从而抑制或掩盖柑橘叶片表面的挥发性物质，减少了亚洲柑橘木虱在寄主上取食，因此可能在一定作用阈值下，就能减少亚洲柑橘木虱在柑橘叶片上的取食，后续尚需通过组织学实验进行确定，同时进一步开展田间试验确定最佳的HMO施用浓度和使用次数。