多基因定向聚合敲除对水稻吉粳809农艺性状及品质的影响

罗 樊，周建平，蔡树琼，郑雪莲，曾 翔，蔡光泽*，张 勇*

(1.西昌学院农业科学学院，四川 西昌 615013；2.电子科技大学生命科学与技术学院，信息生物学中心, 四川 成都 610054)

【研究意义】水稻(OryzasativaL.)是主要粮食作物之一，全球约1/2的人口将其作为主食。在中国，水稻更是保障粮食安全和实现农业可持续发展的主要粮食作物[1]。预计2030年世界人口将达到85亿，这使世界范围内水稻产量提高的育种计划面临着巨大压力。传统水稻育种主要通过杂交和回交的方式实现优良基因的聚合，存在周期长、效率低和工作量大等缺点，而基因编辑技术避免了传统突变体获得过程中的基因连锁和渗透现象，具有育种周期较短、选育针对性强等特点，能够精准、快速地培育优质水稻[2-3]，为水稻育种带来新的契机。【前人研究进展】目前，作为新一代基因编辑技术的CRISPR/Cas9技术，已被广泛应用到水稻[4]、小麦[5]、玉米[6]、大豆[7]、高粱[8]、棉花[9]、番茄[10-11]、甘蔗[12]等作物的品种改良中。CRISPR/Cas9技术已经成为水稻基因编辑最简单、经济和有效的技术，能在水稻基因组水平进行高效定向编辑[13-21]。单株水稻产量由单株分蘖数、每穗粒数和粒重3个因素构成[22-23]。目前，已经鉴定出多个影响这,3个产量构成因素的基因,例如MONOCULM 1 (MOC1)、TEOSINTE BRANCHED1 (OsTB1)、和IDEAL PLANT ARCHITECTURE1 (IPA1)控制水稻的分蘖数[24-27]；GRAIN NUMBER 1a (Gn1a)、DROUGHT AND SALT TOLERANCE (DST)、IPA1和Grains.Height.Date-7 (Ghd7) 调控水稻每穗粒数[24-25,27-29]；Grain Size(GS3), Grain Weight (GW2, GW5), Squamosa Promoter Binding Protein-like 16 (OsSPL16), Ser/Thr phosphatase (OsPPKL1)和GNAT-like Protein (OsglHAT1) 等对水稻谷粒大小起到调控作用[30-38]。Li 等[39]通过 CRISPR/Cas9 技术敲除水稻中的GS3基因，其T2代籽粒表现出粒长和粒重增加，水稻的产量提高。Song等[31]研究表明GW2是负控制水稻籽粒宽度和粒重的主效基因；Ashikari等[28]研究表明GN1a基因编码的是一种降解细胞分裂素的酶，该基因表达减弱会引起花序分生组织中细胞分裂素的积累，进而增加颖花数量和水稻穗粒数。Zhou等[40]运用CRISPR/Cas9 技术对水稻OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因进行敲除，获得GS3、GW2和GN1a三基因敲除突变体，该水稻突变体在温室中籽粒的粒长、粒宽、千粒重、穗长和单穗重均明显增加，显现出巨大的育种潜力。【本研究切入点】但突变体在田间的主要农艺性状、碾米品质、理化品质以及食味值等是否改变尚需研究。【拟解决的关键问题】因此，本研究对水稻吉粳809的OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向聚合敲除突变体在田间的主要农艺性状、产量和品质进行研究，为OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向聚合编辑在育种上的应用提供实践依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

不含转基因成分的水稻吉粳809的OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向敲除突变体由电子科技大学生命科学与技术学院植物基因组工程实验室提供，突变体编号为J50-2(OsGS3:+1 bp/+1 bp，OsGW2:+1 bp/+1 bp，OsGN1a:-32 bp/-32 bp)和J47-1(OsGS3:+1 bp/+1 bp，OsGW2:-1 bp/-1 bp，OsGN1a:+1 bp/+1 bp)，对照试验材料为野生型材料吉粳809，编号为WT，由吉林省农业科学院水稻研究所林秀云研究员提供。

1.2 试验地点

水稻种植实验基地位于西昌市西乡，土壤肥力条件良好，水源充足，排灌方便，周围无大型的遮挡物，光照充分。实验地外围1000 m内无水稻及其它禾本科作物种植。

1.3 试验设计

采用随机区组试验，3次重复。试验材料J50-2、J47-1和WT于2019年4月12日播种，采用地膜秧盘育秧方式，每穴播种1粒。移栽日期为2019年5月25日，移栽时基本苗均为1苗。移栽小区面积为13.30 m2，小区长宽分别为6.19和2.15 m。株行距为19.55和16.73 cm，小区间间距33.30 cm，四周设1.00 m保护行。于移栽后7 d施用春果肥160 kg/667m2(总养分N+P2O5+K2O≥10 %、有机质≥45 %、腐植酸≥10 %、有效活菌数≥0.2亿/g)。成熟收获日期为2019年9月22日，田间管理按照当地日常方式进行。

1.4 测定指标

水稻成熟后，每个小区随机选取10株进行株高和有效分蘖数测定，并将随机选取的10株水稻分别置于室内自然晾干，测定穗长、每穗总粒数、每穗实粒数和结实率，。将谷粒存放3个月后，参照国家标准《GB/T17891-1999 优质稻谷》测定千粒重、谷粒长度、谷粒宽度、糙米率、精米率、整精米率、垩白粒率。蛋白质含量参照国家标准《GB5009.5-2016》第三法测定。直链淀粉含量参照国家标准《GB/T15683-2008》进行测定。大米食味值采用大米食味计(JSWL，日本佐竹公司)测定。垩白度采用大米外观品质检测仪(JMWT12，日本佐竹公司)测定。

1.5 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 25进行分析。

2 结果与分析

2.1 OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因敲除对吉粳809农艺性状的影响

野生型吉粳809和J47-1株系、J50-2株系的农艺性状分析表明，突变体J47-1与J50-2的平均株高比野生型分别增加3.99 %和5.99 %，均表现为极显著差异(图1-a，图1-d)。突变体J47-1与J50-2的平均粒长比野生型增加20.63 %和17.33 %，均呈极显著差异(图1-b，图1-k)。突变体J47-1与J50-2的平均粒宽比野生型分别增加11.66 %和10.79 %，均表现为极显著差异(图1-b，图1-j)。突变体J47-1与J50-2的平均穗长比野生型分别增加9.27 %和9.04 %，均表现为极显著差异(图1-c，图1-f)。突变体J47-1与J50-2的平均分蘖数分别为8.53和8.83个，比野生型减少23.84 %和21.16 %，均呈极显著差异(图1-e)。突变体J47-1与J50-2的平均每穗总粒数与野生型相比均表现为增加，达到极显著差异(图1-g)。但突变体J47-1与J50-2的每穗实粒数比野生型仅增加3.65 %和3.68 %，差异不显著(图1-h)。突变体J47-1与J50-2的平均结实率比野生型分别降低7.68 %和8.49 %，均呈极显著差异(图1-i)。突变体J47-1与J50-2比野生型千粒重增加53.75 %和49.31 %，均呈极显著差异(图1-l)。GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的基本农艺性状的株高、穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、粒长、粒宽和千粒重均有所提高，而每株分蘖数和结实率降低。

2.2 三基因敲除对吉粳809产量的影响

GS3、GW2和GN1a三基因敲除植株J47-1和J50-2产量比野生型分别增产12.62 %和15.78 %，均呈显著差异(图1-m)。表明GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的产量显著提高。

2.3 三基因敲除对吉粳809碾米品质的影响

GS3、GW2和GN1a的糙米率野生型相比无显著差异(图2-b)。突变体J47-1和J50-2的精米率比野生型分别减少4.09 %和2.78 %，其中J47-1与野生型差异显著，而J50-2与野生型差异达极显著(图2-c)。突变体J47-1和J50-2的整精米率比野生型低32.83 %和22.86 %，均呈极显著差异(图2-d)。突变体J47-1和J50-2的垩白率分别比野生型高80 %和84 %，均达到极显著差异(图2-e)。突变体J47-1和J50-2的垩白度比野生型分别高16.37 %和12.20 %，均达到极显著差异(图2-f)。表明，GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的精密率和整精米率显著降低，垩白粒率和垩白度显著增高，而对糙米率影响不大。

2.4 三基因敲除对吉粳809理化品质和食味值的影响

GS3、GW2和GN1a三基因敲除突变体J47-1和J50-2的直链淀粉与野生型的差异不显著(图3-a)。

蛋白质含量上，J47-1和J50-2与野生型的蛋白质含量差异未达显著水平(图3-b)。J47-1、J50-2和野生型的食味值差异也也未达显著水平(图3-c)。表明，GS3、GW2和GN1a三基因敲除对吉粳809的直链淀粉含量、蛋白质含量和食味值均影响不大。

3 讨 论

随着水稻全基因组测序完成，大量调控水稻重要性状的基因的克隆与鉴定，将控制重要性状的基因应用于育种实践的需求越来越迫切。GS3、GW2和GN1a三基因分别是水稻粒长、粒宽和每穗粒数的负调控因子，对水稻产量因素调控起着重要作用[28,31,39]。GS3、GW2和GN1a三基因的敲除对水稻吉粳809的田间基本农艺性状及产量有不同程度的影响。与GS3、GW2和GN1a三基因的敲除获得的突变体与野生型相比，每穗总粒数、穗长、粒长、粒宽和千粒重均显著增加，达到差异极显著水平，其中每穗总粒数增加13.99 %～15.57 %，穗长增加9.04 %～9.27 %，粒长和粒宽分别增加17.33 %～20.63 %和10.79 %～11.66 %，千粒重增加49.31 %～53.75 %，该结果与Zhou等[40]的研究结果基本一致。另外本研究发现，突变体的每穗总粒数增加，但是结实率却显著下降，使每穗实粒数仅增加了3.65 %～3.68 %，且差异未到达显著水平。分蘖也减少21.16 %～23.84 %，差异达到极显著水平。而在Zhou等[40]的研究中却未见结实率和分蘖数下降的报道，造成这些现象的可能原因是本实验在大田环境下，植株与植株间相互竞争有限的肥力、阳光和CO2等资源造成。本研究中突变体的株高增加3.99 %～5.99 %，且差异达到极显著水平，而在Zhou等[40]的研究，川农香粳(CNXJ)的GS3、GW2、GN1a三基因敲除突变体与野生型相比却表现出株高显著降低的现象，这可能是2个不同背景水稻品种的基因相互作用产生的，具体原因有待进一步研究。虽然水稻产量三要素中每穗实粒数和粒重表现出增加，分蘖表现出减少，但最终产量增产达到12.62 %～15.78 %，且差异达到极显著水平。可见GS3、GW2和GN1a三基因敲除方法在水稻增产中有巨大潜力。

GS3、GW2和GN1a三基因的敲除对吉粳809的品质有较大影响。在碾米品质方面，与突变体野生型相比，在糙米率方面无显著差异，但是精米率和整精米率却降低，其中精米率下降2.78 %～4.09 %，而整精米率却下降了22.86 %～32.83 %，且差异都达到显著水平。而整精米率是判断优质米标准的重要指标，所以提高水稻碾米的整精米率是生产优质米的必要途径[41]。因而突变体的碾米品质劣于野生型。在外观品质方面，突变体的垩白粒率和垩白度相比野生型分别增加80.00 %～84.00 %和12.20 %～16.37 %，且差异达到极显著水平。产生这种差异的原因可能是在水稻灌浆期，由于突变体水稻籽粒变大，胚乳没有积累足够的淀粉，导致淀粉粒形状、大小不规则，淀粉粒排列不紧密产生空隙，从而导致垩白度增加，垩白粒率变高。而垩白粒率和垩白大小又和精米率和整精米率成极显著负相关[42]，因而垩白粒率的增加又极有可能是导致突变体精米率和整精米率下降的原因。虽然突变体的外观品质要劣于野生型。但在理化品质方面，J50-2和J47-1的直链淀粉含量和蛋白质含量都与对照J809(WT)差异不大。在食味值方面，突变体和野生型差别也不大。

4 结 论

GS3、GW2和GN1a三基因敲除突变体与野生型相比，在株高、分蘖、穗长、穗粒数、结实率、千粒重等田间农艺性状上都有不同程度的变化，产量表现出明显增加，因而GS3、GW2和GN1a三基因敲除模式在水稻增产中蕴含巨大潜力。但是其外观品质中的垩白粒率和垩白度极显著增加，碾米品质中的精米率和整精米率又表现出极显著降低，使得该方法下获得的整精米产量和品质都会有所下降，因而该方法不适合用在以精米作为商品出售的品种改良中。但是由于其理化品质中的直链淀粉含量、蛋白质含量以及食味值变化不明显，因而该方法用于以糙米(如红米和紫米)和米粉(如糯米粉)的形式作为商品的品种改良上拥有巨大的前途。