石漠生境下金银花内生/根际解磷菌在不同温度及酸碱环境下的生长和溶磷能力

李剑峰，张淑卿,2*，龙 莹，郭金梅,2

(1.贵州师范学院 喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所，贵州 贵阳 550018；2. 贵州师范学院 地理与资源学院, 贵州 贵阳 550018)

【研究意义】探究解磷菌的溶磷能力及对酸碱、温度等环境胁迫因子的耐受性，对分析影响石漠化环境植物根际解磷菌生长和溶磷的影响因素具有重要意义。【前人研究进展】磷是植物生长必需的主要营养元素之一[1]，我国农业生产中磷肥当季利用率不足25 %，由于95 %以上的土壤磷是很难被植物直接吸收利用的无效形式[2]，提高土壤磷素的利用率成为降低化肥用量的热点问题[3]。土壤解磷菌能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态[4]。环境因素会影响解磷微生物的分布和解磷能力，有研究表明，根际解磷菌能与其他土壤微生物产生相互作用[5]，红树林根际解磷菌的解磷能力受初始pH值的影响[6]，温度过高或过低都不利于菌株发挥解磷作用[7]，羊草根际分离出的解磷菌可在pH 8.5～10正常生长[8]，不同碳、氮和钾源对香椿根际解磷菌溶磷能力有较大影响[9]。【本研究切入点】目前国内外有关解磷菌的探讨已较为深入，并有研究逐渐将解磷菌的解磷机理发展到分子水平[10]。但针对西南石漠退化生境中先锋植物根际解磷菌的报道相对较少，而土壤有效磷的缺乏正是制约西南石漠退化区域植被恢复的主要因素[11]，在轻度至强度石漠化土壤中有效磷仅有3.43～5.69 mg/kg)，处于严重缺磷的状态[12]。金银花(Lonicerajaponica)为忍冬科忍冬属多年生植物，是石漠退化生境的先锋植物，广布于东亚和北美地区[13]。其植株生长期长达20余年，发达的根系能不断穿越岩缝向岩层深入，随着植株生长年限的增加，根际土壤的有效磷含量还在逐年增加[14]，这一现象与其根际解磷菌的解磷作用有关，但金银花根际解磷菌对温度及酸碱胁迫的抗逆性尚不明确。【拟解决的关键问题】筛选适宜于石漠化环境解磷效率高、抗逆性强的菌株，为开发适用于石漠化生境的植物解磷菌剂提供菌种资源，服务于石漠化地区的生态恢复建设。

1 材料与方法

1.1 采样地生境

采样地位于贵州省贵阳市乌当区东风镇(25°59′31.05′′ N， 109°04′08.40′′ E)，地处亚热带季风湿润气候区，雨量充沛气候温和，年均温15 ℃，年日照时数1285 h，年均降水量约1174 mm，11月至次年2月降雨较少，仅占全年降水的7.9 %，降水多集中在4-10月。样地相对湿度70 %左右，年均无霜期约270 d。

1.2 材料

1.2.1 金银花(Lonicerajaponica)野生新鲜植株 采集于仅有金银花单一群落分布岩砾裸露的典型重度石漠化坡地上，采集时尽可能避免根系损伤，植物样品置于5 ℃保温袋，1 h内带回实验室进行处理。

1.2.2 培养基 ①PKO溶无机磷培养基参照PIKOVSKAYA[15]的方法配制，葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，FeSO40.003 g，酵母粉0.5 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉18 g，Ca3(PO4)25 g过0.2 mm筛后单独灭菌后与培养基混合，调节到pH(7.0±0.1)。②蒙金娜溶有机磷培养基参照周佳宇等[16]的方法配制，葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，酵母膏0.4 g，CaCO35 g，蒸馏水1000 mL，琼脂粉18 g，卵磷脂0.2 g以5 mL 75 %的酒精加热溶解，121 ℃单独灭菌25 min，温度降至70 ℃后与培养基混合，调节为pH(7.0±0.1)，制成9 cm琼脂平板。

1.3 解磷菌菌株的筛选

植物材料参照李剑峰等[17]的方法进行组织分离和表面灭菌。在无菌操作台内将表面消毒完全的植株各部位用无菌手术刀分离成根、茎、叶、种子等部分。取植物组织或根际土壤0.5 g加无菌水5 mL，在无菌研钵内研磨匀浆振荡后转入10 mL刻度试管，加无菌水配制成1×10-1～1×10-5的梯度浓度稀释液。取上清液0.2 mL，以稀释平板法分别均匀涂抹至蒙金娜溶有机磷培养基和PKO溶无机磷磷培养基上，28 ℃培养5～7 d。以每平板10～30个菌落的稀释度为最佳稀释度，在最佳稀释度涂抹PKO固体平板上选取可形成解磷透明圈的代表性菌落，以划线法挑取菌体在PKO培养基上分离纯化。通过分离、筛选代表性解磷菌菌株。将筛选出的根际解磷菌株及PMN1513(CK)接种于PKO培养基上(温度为28 ℃，pH 7.0)培养纯化。菌株解磷和生长能力 以平板菌落直径和溶磷圈径法[18]进行评价和计算。

溶磷指数=溶磷圈直径/菌落直径

1.4 温度和酸碱环境对解磷菌生长及溶磷能力的影响

以PKO溶无机磷培养基和蒙金娜溶有机磷培养基为基础培养基，设计温度和酸碱梯度，分别检测温度、酸碱度对解磷菌生长及溶磷能力的影响。

1.4.1 温度 将生化培养箱的温度分别设置为0、4、16、22、28(CK)、34、40 ℃，共7个水平，分别在PKO培养基和蒙金娜培养基上点接菌体，在生化培养箱内培养，每个水平4次重复。

1.4.2 酸碱度 分别将培养基的pH值调节至6.0、7.0(CK)、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，共8个水平，每个水平4次重复，接入菌体后置于28 ℃生化培养箱培养。

1.5 数据统计分析

试验数据采用Excel 2003收集和整理数据。利用SPSS 17.0统计分析软件进行数据分析(Ducan法，P<0.05)，不同小写字母代表处理间差异显著。

2 结果与分析

2.1 筛选的解磷菌菌株溶磷能力的测定

在金银花植株及根际土壤中共筛选出7株解磷菌,分别为PMN1513、PMN1502、PMN1504、PMN1510、PMN1505、PMN1506和PMN1509，菌株均可在溶有有机磷的培养基上形成湿润的粘稠培养物，较其他菌株生长快，能在2～5 d内形成溶磷透明圈，均表现出强解磷能力。PMN1513分离自金银花茎下部，菌体均呈乳白色，生长速度快，解磷固氮能力强；PMN1502选自金银花根下端组织，菌体均呈半透明乳白色，形成中央凸起的圆形菌落；PMN1504、PMN1510均分离自金银花须根组织，菌落白色圆形凸起状；PMN1505和PMN1506均分离自金银花根上端组织，菌体呈白色，解磷能力强。PMN1509选自金银花根部附着土，解磷能力较强，形成中央凸起的乳白色圆形菌落。

2.2 解磷菌菌株的溶磷能力

2.2.1 溶无机磷能力 在PKO溶无机磷培养基上(温度为28 ℃，pH 7.0)培养的7株菌中有6株出现明显的透明溶磷圈，仅PMN1506未出现溶磷圈。说明大部分根际解磷菌均具有溶解无机磷能力。其中，PMN1513的溶磷指数(1.55)显著高于其他供试菌株(P<0.05)，其溶无机磷的能力最强；其次是PMN1510和PMN1509，溶磷指数显著高于PMN1502、PMN1504、PMN1505(图1)；PMN1502、PMN1504、PMN1505菌株均能生长，但PKO培养基上未见溶磷透明圈。

2.2.2 溶有机磷能力 温度为28 ℃，pH 7.0的环境下，在蒙金娜溶有机磷培养基上培养的7株解磷菌均出现透明溶磷圈，表明这7株解磷菌均有溶有机磷能力。PMN1510和PMN1513的溶磷指数最高，均显著高于其他菌株(P<0.05)。PMN1506解有机磷指数最低，仅为PMN1513的52.61 %(图2)。

2.3 不同温度下解磷菌的溶磷能力

2.3.1 溶无机磷能力 从图3看出，在PKO无机培养基中连续培养8 d，供试菌株在温度低于4 ℃时均不能生长；在16～34 ℃能正常生长且有溶无机磷的能力，但是各株耐受力存在差异。菌株PMN1513、PMN1502、PMKN1505在温度16～40 ℃均能生长且能溶无机磷，表现出对温度具有较宽的适应范围；PMN1513溶磷能力较强，其在16 ℃时溶磷能力达最大值，之后随着温度的升高而降低。PMKN1502在16～40 ℃均能生长，且溶磷效果相同，不受温度的影响。PMN1506在28 ℃未能生长，而在16～22 ℃及34～40 ℃均能生长且具有溶磷能力，对温度的适应性表现为两极性。PMN1509在28 ℃溶磷能力低于34 ℃，溶磷指数分别为1.26和1.38，说明PMN1509更适应高温环境。

2.3.2 溶有机磷能力 从图4看出，在蒙金娜溶有机磷培养基中连续培养8 d后，温度低于4 ℃时，菌株均不能生长；在温度为16～34 ℃均能生长且具有溶有机磷的能力，但是各株耐受力存在差异。大部分供试菌株在16～28 ℃溶有机磷能力随温度的升高先下降后上升；28～40 ℃各菌株溶有机磷能力随温度的升高而下降。温度为40 ℃时，PMN1513溶磷效果最好，溶磷指数为2.15；温度为16 ℃时，PMN1513溶磷效果依旧最好，溶磷指数为3.28，说明其对温度有较宽的适应范围。PMN1509在34 ℃时溶磷指数为1.88。而16 ℃时溶磷指数为1.0。相对于低温环境，说明其更适于生存于高温环境且发挥溶磷效果。多数菌株均能在28 ℃环境条件下生长并发挥溶磷作用，而在16 ℃时生长及溶磷能力更佳，在16 ℃培养下，供试菌株中有6株溶磷菌表现出最高的溶磷能力。

2.3.3 菌株在有机、无机磷培养基中的生长情况 将7株解磷菌在34 ℃下连续培养8 d后，各菌株在蒙金娜溶有机磷培养基中均能生长，在PKO溶无机磷培养基中除PMN1510外均能生长，但各菌株菌落直径存在差异(图5)。解磷菌株PMN1509在PKO溶无机磷培养基上的菌落直径可达4.07 cm，菌落生长速度快其他供试菌株；PMN1513在蒙金娜溶有机磷培养基中的菌落直径可达6.11 cm，均优于其他供试菌株；而各解磷菌株在PKO溶无机磷培养基和蒙金娜溶有机磷培养基中的菌落直径间并无相关性。

2.4 不同酸碱度环境下解磷菌的溶磷能力

2.4.1 溶无机磷能力 由图6所示，连续培养8 d后，供试菌株对碱胁迫的适应和解磷能力存在差异。在有机磷培养基上，供试菌株对不同程度的碱胁迫具有一定的耐受能力，对碱性环境适应范围较广；其中有6株解磷菌在pH 6.0～13.0可形成菌落并溶解有机磷。PMN1509仅能在pH 6.0～10.0的范围内生长，对酸碱性环境适应范围较小，对碱的适应范围较差。PMN1505在pH 6.0时菌株溶有机磷能力为PMN1513的53 %，pH 9.0时可达104 %，在pH 12.0时也可达120 %，表明该菌株对酸碱性环境的适应范围较广，但偏碱性环境下溶磷能力优于偏酸性环境。PMN1510在pH 7.0时菌株溶有机磷能力与PMN1513无显著差异，而在其余pH条件下，菌株溶有机磷能力不受pH大小的影响。

2.4.2 溶无机磷能力 从图7看出，菌株在PKO溶无机磷培养基上对酸碱环境适应范围较广。供试解磷菌在pH值为6.0～10.0的PKO无机培养基中均能连续生长8 d以上。其中，PMN1513、PMN1502、PMN1504、PMN1505在pH 7.0～11.0均能生长并能持续溶解无机磷，表明菌株对碱性环境适应范围较广，PMN1513在该pH范围内解无机磷能力最为稳定，除pH 8时与PMN1504差异不显著外，均显著高出其他菌株(P<0.05)；PMKN1504在pH 6.0、11.0时菌株溶磷能力仅分别为PMN1513的87 %和50 %，差异显著(P<0.05)； PMKN1509在pH 6.0、9.0时菌株溶磷能力分别为PMN1513的76 %和96 %，在pH 10.0时仅为PMN1513的78 %，当pH达到11.0时，菌株不再生长，表明该菌株对碱胁迫的耐受能力较弱。

2.4.3 碱胁迫和弱酸条件下菌株生长情况 从图8看出，在pH 13的碱性环境下，供试7株解磷菌中有5株均能在PKO溶无机磷培养基和蒙金娜溶有机磷培养基中形成菌落并产生溶磷透明圈。PMN1509在2种培养基中均不能生长，表明该菌株无法适应该碱性环境。在PKO溶无机磷培养基中，PMN1513生长最好，菌落直径为3.93 cm，显著高出其他菌株(P<0.05)；在蒙金娜溶有机培养基中PMN1502生长最好，菌落直径为6.21 cm。各解磷菌株在PKO溶无机磷培养基及蒙金娜溶有机磷培养基中菌落大小间缺乏相关性。

从图9看出，pH 6.0的弱酸性环境下，供试7株解磷菌在PKO培养基上均能生长，但存在一定的差异。菌株PMN1506的生长最好，在PKO溶无机磷培养基和蒙金娜溶有机磷培养基中菌落直径分别为6.15和3.78 cm，显著高于其他菌株(P<0.05)；除PMN1513外，其余6株解磷菌在PKO溶无机磷培养基上形成的菌落直径均优于在蒙金娜溶有机磷培养基上的菌落直径，表明弱酸环境利于供试菌株在PKO溶无机磷培养基中生长。

3 讨 论

3.1 菌株在不同酸碱及温度环境下的溶磷能力

供试解磷菌株中，具有溶无机磷能力的菌种占供试代表性菌株的86 %，而全部菌株均能溶解难溶性有机磷，但不同供试菌株溶磷能力间存在较大差异。溶有机磷和溶无机磷能力最强的菌株均为PMN1510，溶无机磷指数在1.0～1.55。溶无机磷能力最低的是PMN1505，溶有机磷指数在1.51～2.87。溶有机磷能力最低的是PMN1506。各供试菌株的溶磷指数随不同温度、pH环境而存在较大差异，印证了赵小蓉等[19]有关解磷菌在不同条件下的解磷能力会产生较大差异的结论，与刘小玉等[20]的研究即解磷微生物的解磷能力会随着外界环境或是养分供应的变化而存在差异的结论一致，这可能是由于不同的酸碱环境和养分供给条件会改变解磷菌的生长代谢途径，甚至影响解磷菌生长和繁殖而导致解磷能力不稳定。

3.2 温度对解磷菌解磷能力的影响

供试菌株在温度为16～34 ℃能生长且有溶磷能力，溶磷能力随温度的升高呈先升高再降低的趋势。温度高于34 ℃菌株生长变缓，温度低于4 ℃时则均不能生长。PMN1513，PMN1502和PMN1505在温度16～40 ℃范围内均能正常生长，表现出对温度具有较宽的适应范围。通过分析菌株的分离来源发现，分离自金银花茎部的内生解磷菌PMN1513对温度的抗逆及解磷能力普遍强于根际土壤中的解磷菌。这与李鸣晓等[21]高温堆肥中筛选出5株耐高温解磷菌，发现其最适生长温度为40～50 ℃的结果相似。表明供试菌株可耐受40 ℃的高温，可能与宿主植株生长环境有关，宿主金银花广泛分布于全国南方多个省市[22]，多能在高达40 ℃的高温下生存，但通常不会长期维持在50 ℃高温以上。解磷菌宿主所处的环境也会对菌株耐热性和在热胁迫下的解磷能力产生影响。

3.3 碱胁迫对解磷菌解磷能力的影响

在PKO无机培养基中连续培养8 d后，所培养的7株解磷菌都能在pH值为6.0～10.0的范围内能生长，表明所测菌株对弱酸和弱碱环境均有适应能力。其中PMN1513、PMN1502、PMN1504和PMN1505在pH值为7.0～13.0的范围内均能生长并能溶解无机磷，表明这些菌株对碱性环境适应范围较广。在蒙金娜有机培养基中连续培养8 d后，供试7株解磷菌中的6株在pH值为6.0～13.0的范围内能生长并能溶解有机磷，表明所测菌株对弱酸及中强碱性环境的适应范围广。其中PMN1509仅能在pH值为6.0～10.0的范围内生长，表明该菌株对强碱性环境的适应范围较差。分离自金银花茎的内生解磷菌PMN1513对酸碱性环境的抗逆及解磷能力普遍强于根际土壤中的解磷菌。根际解磷菌中解磷抗逆能力以须根内生解磷菌最高，根际土壤解磷菌最低。供试菌株溶解有机磷能力强于溶解无机磷能力。但由于微生物溶解有机磷与无机磷的机理不同，培养介质的pH能衡量无机磷解磷能力，但不能作为衡量有机磷解磷能力的指标。可见pH不能成为菌株解磷能力强弱的唯一指标[23]。

由金银花茎部分离出的菌株解磷抗逆能力强于根际解磷菌，这可能与各部位所处的环境条件有关。推测是由于根部常年埋于土壤内，土壤对其起到一定的保护作用，而茎部常年暴露于空气中，内生解磷菌受外界环境因子的影响使耐逆性更强所致，所以茎部解磷菌的抗逆能力强于根际解磷菌。因为在喀斯特石漠化环境下，土层薄且有裸露的岩石[24]，温度正常或偏低时土层可以对植株根起到保护作用，而外界温度较高时，接近土壤外裸露的岩石则可能对植株根部产生热胁迫，影响解磷菌的解磷能力。

4 结 论

在金银花植株及根际土壤中分离的菌株在温度为16～34 ℃均能生长并具有溶磷能力，但是各菌株之间存在差异。一定范围内，各菌株菌落直径随温度的升高呈先增大后减小的趋势，温度高于34 ℃菌株生长能力减弱，温度低于4 ℃时菌株均不能生长。7株解磷菌在pH为6.0～10.0能生长并且具有溶磷能力，表明所测菌株对酸碱环境适应能力一般。在PKO无机培养基中PMN1513、PMN1502、PMN1504、PMN1505在pH值为6.0～13.0的范围内均具有溶磷能力，对酸碱有较宽的适应范围。在蒙金娜溶有机磷培养基上，7株解磷菌中有6株解磷菌在pH 6.0～13.0能生长并且具有溶磷能力，表明所测菌株对酸碱环境适应范围广。其中PMN1509仅能在pH值为6.0～10.0的范围内生长，表明菌株对酸碱适应范围较小，对碱的适应范围较差。随着培养时间的增加，溶磷能力逐渐减小。

根部不同分离部位的解磷菌解磷抗逆能力为须根内生解磷菌>主根内生解磷菌>根际土壤解磷菌。分离自金银花茎部的内生解磷菌抗逆及解磷能力普遍强于根际土壤中的解磷菌；pH为6.0的环境下，解磷菌PMN1513的解磷能力最强，溶无机磷和溶有机磷的溶磷指数分别达2.19和2.72。16 ℃环境下，除PMN1509外，供试的6株解磷菌均达到不同温度下的最高解磷能力。解磷菌PMN1513的解磷能力最强，对难溶性无机磷和有机磷的解磷指数分别达2.46和3.28。研究从极端石漠植物中分离筛选与本地环境相适应的解磷效率高、抗逆性强的菌株，解磷菌PMN1513可用于石漠土壤解磷菌剂的研发，具有良好的应用潜力，可为适用于石漠生境下的植物促生解磷菌菌剂提供菌种资源。