云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性与籼粳基因型的相关性分析

陈 越，陈 玲，钟巧芳，张敦宇，李娥贤，王文心，王 波，王玲仙，柯 学，程在全，肖素勤*

(1.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业农村部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南 昆明 650205；2.元江县植保植检站,云南 元江 653300)

【研究意义】褐飞虱(NilaparvatalugensStal)是中国乃至亚洲水稻生产上危害最严重的迁飞性害虫之一，褐飞虱其成虫和若虫在取食为害水稻的同时还会传播多种水稻病毒病，对水稻的生产和粮食安全产生极大地威胁[1]。长期以来，对褐飞虱的防治一直以喷洒杀虫剂为主，虽然现在已经开发了很多可以替代传统农药杀虫剂的环境友好型绿色杀虫剂，但长期的使用也大大地增加了水稻的生产成本。因此，从水稻资源中挖掘抗褐飞虱种质进而培育、推广抗褐飞虱水稻品种是最经济有效的措施，也是中国防治褐飞虱为害的重要策略。水稻的地方品种资源是由野生稻演变而来，对种植地生态条件及水稻流行性病虫害具有较强的适应性和耐受性[2]。云南作为中国最优异地方稻种资源的集中地，被誉为“稻之王国”，云南水稻地方品种资源蕴含很多优异抗病抗逆基因，是中国水稻育种和农业生产及科学研究中非常重要的物质基础，具有较高的学术和应用价值[3-4]。水稻品种的抗虫性筛选一直都是一个研究热点，自20世纪60年代以来，亚洲各水稻生产国的研究者相继开展从水稻地方品种资源中筛选抗褐飞虱品种的工作，中国的水稻研究者也先后从四川[5]、江苏[6]、广东[7]、江西[8]、广西[9]等多个省份或地区的水稻地方品种资源及水稻材料中成功地筛选到许多适应当地生态条件的褐飞虱的抗性品种。【前人研究进展】前期的研究发现抗褐飞虱基因资源主要存在于籼稻和野生稻中，而在地理分布上，籼稻主要存在于温暖气候条件下的热带和亚热带的低纬度海拔地区，这些地区也是褐飞虱的常发区和重发区，也就是说抗褐飞虱基因主要存在于褐飞虱频繁发生区的籼稻品种中[7,10]。因此，探明水稻褐飞虱抗性与其籼粳分化的相关性，将有利于揭示水稻抗虫基因的起源，也为进一步从水稻地方资源中筛选抗褐飞虱种质提供了有利指导。随着分子生物学和水稻基因组学的迅速发展，使得基于籼、粳稻DNA分子水平上与籼粳分化相关的差异序列而设计的InDel标记得到广泛应用，该标记通过统计水稻品种在不同InDel位点上的籼粳基因频率对其籼粳属性进行划分，并具有PCR带型简单、快速、准确、高效的特点[11]。王友林等[12]用19对InDel籼粳特异性标记准确地检测出12个杂交稻及其亲本材料的籼粳类型，并对杂交稻的杂种优势进行预测，结果表明InDel标记不仅可以高效准确的检测出水稻的籼粳类型，而且在杂种优势预测方面也具有较大的潜力。【本研究切入点】近年来，已有一些研究涉及水稻籼粳分化与抗虫性[13]、籼粳分化与病原菌致病性[14]之间的联系的报道，但基于籼粳差异序列设计的InDel标记对水稻地方品种资源进行籼粳属性鉴定，并分析籼粳基因频率与褐飞虱抗性的相关性未见报道。【拟解决的关键问题】通过田间自然种群鉴定法及39对InDel籼粳特异性标记对云南省10个地州(市)40个县(区)的176份水稻地方品种资源进行褐飞虱抗性的初筛和籼粳属性的鉴定，并分析云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性级别与籼粳基因频率之间的关系，以期揭示云南水稻地方品种资源不同籼粳基因型在褐飞虱抗性方面的差异，为今后进一步筛选抗褐飞虱水稻种质及褐飞虱抗性基因的起源研究提供指导，也为利用云南水稻地方品种进行抗虫育种时确定合适的籼粳配比、科学利用籼粳互渗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的176份云南水稻地方品种资源来自云南省的10个地州(市)40个县(区)，均由云南省作物种质资源库提供，以典型粳稻日本晴和典型籼稻9311作为籼粳属性划分对照品种，以9311和保存于云南省玉溪市元江县实验基地内的药用野生稻分别作为感褐飞虱和抗褐飞虱的对照品种。

1.2 云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性鉴定

供试的176份云南水稻地方品种资源及9311(感褐飞虱对照)于2018年7月中旬播种在云南省玉溪市元江县实验基地里的药用野生稻异位保护点内，元江县地处低纬度高原地区，属季风气候，全年气候炎热，每年的8-10月有大量的褐飞虱虫源迁入，是水稻褐飞虱的常发区和重发区[15]。采用田间自然迁入虫源方式对云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性进行鉴定，以元江县植保植检站(http:// www.nyj.yuxi.gov.cn/news14277/20180919/7002711.shtml) 分布的该年褐飞虱迁入虫量作为褐飞虱达到发生要求的依据。每份水稻地方品种资源分2行单株种植20株，行株距为20 cm×15 cm，所有资源随机排列，设置3次重复，每10份水稻地方资源种1行感褐飞虱品种9311，每个云南地方品种资源的重复内移栽1行抗褐飞虱对照药用野生稻的稻桩，从播种到褐飞虱抗性调查结束期间仅防治病害，不进行任何杀虫处理，水肥按常规稻田管理。当感虫对照9311枯死率达到90 %时[16]参照刘光杰等[17]对褐飞虱抗性水平的评价标准(表1)，以目测法按受害程度评定云南水稻地方品种资源对褐飞虱的抗感性。

表1 水稻材料抗褐飞虱的鉴定评价标准Table 1 Evaluation standard for resistance of varieties to the brown planthopper

1.3 云南水稻地方品种资源籼粳类型的鉴定方法

1.3.1 用于籼粳分类的InDel标记的筛选 用籼粳对照材料(日本晴、9311)和分别来自不同地州(市)的10份地方稻资源从卢宝荣等[18]报道的45对InDel标记中筛选出可用于云南水稻地方品种籼粳分类的标记。在45对标记中删除R2M24、R3M37、R5M30、R7M37、R9M10及R12M10，其余39对条带清晰且在不同来源的10份云南水稻资源中均能扩增出与典型粳稻(日本晴)或典型籼稻(9311)条带类型相吻合的籼-粳特异性标记，所用标记由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.2 InDel标记的检测 水稻基因组DNA提取及PCR扩增参考陈越等[5]方法，用4 %琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，拍摄并分析电泳结果。

1.3.3 云南水稻地方品种资源的籼粳基因频率计算与籼粳划分标准 参照卢宝荣等[18]报道的水稻籼粳基因频率的计算方法和公式，统计云南水稻地方品种资源在39个InDel籼粳特异性标记上的籼粳基因型数据，计算176份云南水稻地方品种资源的籼粳基因频率，按照表2中的籼型、粳型基因频率的InDel划分标准划分其籼粳类型。

1.4 数据分析

用SPSS 20.0软件进行褐飞虱抗性级别与籼型基因频率的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 云南水稻地方品种资源的籼粳鉴定结果

筛选出的39对InDel标记在扩增176份资源时均未出现空白条带，部分资源扩增带型见图1。根据176份云南水稻地方品种资源在39对InDel籼粳特异标记扩增下的不同籼粳基因型，计算每份资源的籼、粳基因频率。按照表2中的分类标准对云南水稻地方品种资源的籼粳类型进行划分，由表2可知176份云南水稻地方品种资源中鉴定为籼稻(84份)的数量最多，占47.73 %，其次为典型籼稻(28份)、粳稻(26份)、典型粳稻(25份)分别占15.91 %、14.77 %、14.20 %，而渗入较多亚种片段的偏粳(2份)、偏籼(5份)和中间型(6份)的资源较少，3种籼粳类型仅占7.39 %。分析结果表明，云南10个州(市)40个县(区)的176份水稻地方品种资源以籼型基因频率(0.60的籼型稻(典型籼稻、籼稻及偏籼)为主。

表2 籼型(Fi)或粳型(Fj)基因频率的InDel分类标准及不同籼粳类型中抗褐飞虱的资源数量Table 2 InDel classification standard of indica gene frequencies or japonica gene frequencies and the number of brown planthopper resistant resources in different types of indica-japonica rice varieties in Yunnan

2.2 云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性

供试的176份云南水稻地方品种资源经褐飞虱田间自然鉴定结果显示(表2)，176份水稻地方品种资源被褐飞虱伤害后表现出的抗感水平也不尽相同，共有45份资源对褐飞虱有抗性，其中有2份资源(普洱市的安南谷和西双版纳州的老来红)表现为抗，占1.14 %；43份资源表现为中抗，占24.43 %；而表现为中感、感虫及高感的资源分别为48、36和47份，分别占供试资源的27.27 %、20.45 %、26.70 %。供试的176份云南水稻地方品种资源中以感褐飞虱的品种为主，只有少数品种资源表现出抗性。

2.3 云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性与籼粳基因频率的相关性

供试的176份资源的籼型基因频率与褐飞虱抗性级别的相关性分析呈极显著负相关，相关系数r=-0.345，P<0.01。由表2看出，28份籼型基因频率在0.91～1.00的典型籼稻中对褐飞虱表现为中抗的资源有9份，其余19份资源均无抗性；84份籼型基因频率在0.77～0.90的籼稻资源中有2份(普洱市的安南谷(Fi=0.85)和西双版纳州的老来红(Fi=0.87))对褐飞虱表现为抗虫，有32份对褐飞虱表现为中抗，50份为无抗性；5份籼型基因频率在0.62～0.71的偏籼资源中除来自临沧市的乌咀糯(Fi=0.69)对褐飞虱表现为中抗，其他偏籼资源均不抗褐飞虱；6份籼型基因频率在0.42～0.58的中间型资源及2份籼型基因频率为0.28和0.40的偏粳资源对褐飞虱均不表现出抗性；26份籼型基因频率在0.13～0.26的粳稻中除来自临沧市的糯谷(Fi=0.13)对褐飞虱表现为中抗外，其他粳稻资源均不抗褐飞虱；25份籼型基因频率≦0.1的典型粳稻资源对褐飞虱均没有抗性。从以上数据可以看出鉴定为抗褐飞虱的45份资源中除临沧市的糯谷(中抗)为籼型基因频率为0.13的粳稻资源，其余44份对褐飞虱有抗性的均为籼型基因频率在0.69～1.00的籼型稻资源，以上结果表明籼型基因频率与褐飞虱抗性密切相关。

3 讨 论

栽培稻是全球也是中国赖以生存的主要粮食作物之一，中国作为亚洲栽培稻的起源地之一具有悠久的水稻栽培历史，在1800多年前的东汉时期就形成了“南籼北粳”的种植区划[19]。籼稻和粳稻由于其在地理分布、农业生态环境及农耕模式的不同，形成了在形态特征、解剖结构、细胞水平、蛋白质水平、DNA水平上差异显著的两个亚种[20]。近年来，随着比较基因组学的发展及籼稻9311和粳稻日本晴全基因组测序工作的完成，使得如SSR、RFLP、RAPD及ILP等分子生物学技术成功用于水稻籼粳类型的鉴定，其中应用最多的是针对栽培稻籼粳亚种在DNA水平上的差异而设计开发的InDel标记。卢宝荣等[18]，蔡星星等[21]，陈萍萍等[22]先后用已知籼粳属性的水稻材料或程式指数法分别对InDel籼粳鉴定法予以验证，证实了其在栽培稻、野生稻甚至稻属的不同近缘种材料籼粳鉴定上的可行性、有效性及准确性。对来自云南10个地州(市)40个县(区)的水稻地方品种资源的籼粳属性利用39对InDel籼粳特异标记进行鉴定，发现云南水稻地方品种资源的籼粳分化明显，InDel分子指数法划分的7种籼粳类型均有存在，176份材料以籼型基因频率(0.60的籼型稻为主，其中籼稻(84份)和典型籼稻(28份)占所有品种资源的百分比较其他类型高，分别为47.73 %和15.91 %，而偏粳、偏籼及中间型资源的数量比其他类型低，仅为2、5和6份，可能是由于这些渗入大量亚种片段的籼粳类型含有较多不稳定、不利性状而导致在自然选择和人工驯化过程中逐渐被淘汰，姚国新等[12]的研究也有相同的结果。

云南因其独特的气候、复杂的地形及多民族文化背景的差异，形成了多样性丰富的地方稻品种，已有学者在云南地方稻中发现孕穗开花期耐冷性极强、抗稻瘟病、抗白叶枯病、矮秆等优异资源，为水稻的遗传改良提供了多样的基因资源[3]。本研究以多样性丰富且含有较多优异基因的云南水稻地方品种资源为试验材料，以田间自然迁入褐飞虱虫源的方式对其褐飞虱抗性进行鉴定，结果表明176份云南水稻地方品种资源中有45份资源对褐飞虱具有抗性，占供试资源的25.57 %，其中来自普洱市的安南谷和西双版纳州的老来红对褐飞虱表现为抗，43份表现为中抗，其他131资源均不抗褐飞虱。在45份抗褐飞虱的资源中除临沧市的糯谷(Fi=0.13)为粳稻外其他资源均为籼型基因频率>0.60的籼型稻材料。分析176份云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性级别与籼型基因频率的相关性分析结果呈极显著负相关(r=-0.345，P<0.01)，也就是说含有较高籼型基因频率的资源对褐飞虱抗性强，即籼型基因频率>0.60的籼型稻资源携带抗褐飞虱基因的概率高于籼型基因频率≦0.60的资源。苏昌潮等[2]对515份来自越南和中国(云南、贵州、广西及太湖流域)4个地区水稻资源的褐飞虱抗性鉴定以及对褐飞虱表现出抗性的资源的籼粳属性鉴定结果也有相同的结论，发现大部分抗褐飞虱的资源为籼稻材料。而褐飞虱抗性资源多分布于种植籼稻的热带或亚热带的低纬度海拔地区，而这些地区往往也是褐飞虱发生为害水稻的地区，Yoshihara[23]和Shigematsu[24]的研究发现抗褐飞虱籼稻品种中存在抑制其取食的草酸和β-谷甾醇，进一步证明了褐飞虱抗性基因主要存在于籼稻品种中。

4 结 论

InDel标记具有较强的籼粳特异性，在籼粳属性鉴定方面具有较好的区分效果。通过对供试的176份云南水稻地方品种对褐飞虱抗性与籼粳分化的相关性分析表明，褐飞虱抗性级别与籼型基因频率呈极显著负相关，说明水稻的籼型基因频率越高，对褐飞虱的抗性越强。通过田间自然鉴定法筛选出对褐飞虱表现出抗性的45份资源，其中2份(普洱市的安南谷和西双版纳州的老来红)表现为抗的资源可作为培育抗褐飞虱品种的亲本材料，以丰富云南的抗褐飞虱种质资源。通过研究明确了云南水稻地方品种资源的褐飞虱抗性与籼粳基因频率之间的相关性，为今后深入研究褐飞虱抗性基因的起源及抗褐飞虱资源的定向遗传改良等方面提供了参考。