甘薯腐烂茎线虫重组酶聚合酶扩增方法的建立与应用

马居奎，张成玲，杨冬静，谢逸萍，孙厚俊

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室，江苏 徐州 221131)

【研究意义】甘薯腐烂茎线虫(DitylenchusdestructorThorne)又称马铃薯腐烂茎线虫，是一种寄生于重要经济作物的迁移性内寄生线虫，可寄生超过120种植物[1-2]。甘薯腐烂茎线虫最早发现于美国的储藏甘薯中[3]，主要发生在温带及亚热带地区，现有报道的发生区域包括亚洲、非洲、北美洲、南美洲、大洋洲和欧洲[4]。为控制其传播扩散，该线虫已被亚太植物保护组织及许多国家和地区列为植物检疫性有害生物。甘薯腐烂茎线虫在国外主要为害马铃薯，平均每年给美国马铃薯产量的损失达10 %以上[5]。在我国，主要为害甘薯，是我国北方薯区甘薯生产的三大病害(茎线虫病、黑斑病、根腐病)的病原之一。【前人研究进展】自1937年首次报道以来，甘薯腐烂茎线虫病已成为北方薯区最严重的的病害。主要为害甘薯地下茎及块根，严重时可扩展至地上茎部，一般可引起甘薯产量减产30 %～50 %，严重时可达到80 %以上，甚至绝收[6]。近年来，该线虫在我国河北、甘肃、内蒙古和黑龙江地区为害马铃薯的现象被陆续报道[7]。此外，陈品三(1988)和王玉娟(1990)等先后报道了甘薯腐烂茎线虫可引起当归麻口病[8-9]。由于我国在过去很长一段时间里未对该线虫病害进行系统的调查和准确鉴定，导致甘薯腐烂茎线虫通过甘薯种薯运输、种苗调运、农事操作以及花卉植物的种苗、苗木运输等途径，已扩散到我国十多个省。目前，腐烂茎线虫的种类鉴定主要通过利用雌成虫的形态学特征，但当只有幼虫、卵和雄虫时，形态学就不能识别。此外，该线虫存在明显的种内分化现象，不同群体在致病性、基因型和形态学方面都存在明显的差异[10]。由于形态学鉴定方法耗时长、操作复杂需要较强的专业技能，因此基于DNA的分子检测技术逐渐成为线虫检测最常用的手段，主要包括随机扩增多态性DNA技术(RAPD)、特异引物PCR技术、实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)等[11-16]。PCR技术和Real-time PCR技术具备准确、高效、灵敏度高的特点，同时可实现对根际线虫的定量检测；但以PCR为基础的分子检测需要相对高质量的DNA模板，扩增和检测需要PCR仪等，且检测过程需要数小时，存在对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高的缺点。近年来，随着分子生物学技术的发展，恒温核酸扩增技术越来越受到关注。该技术在恒温条件下进行且反应更加迅速，不需要昂贵热循环仪等仪器设备[17]。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶参与的恒温扩增新技术，可在37～42 ℃下连续进行反应，反应时间只需15～30 min。该技术已应用于南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和象耳豆根结线虫等根际线虫的分子诊断[18-20]。【本研究切入点】本文以甘薯腐烂茎线虫ITS序列设计特异性RPA引物，采用不同甘薯腐烂茎线虫地理群体进行验证，建立甘薯腐烂茎线虫RPA反应体系。【拟解决的关键问题】本研究结果为快速检测甘薯腐烂茎线虫提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试线虫 供试线虫群体名称、寄主及地理来源见表1。

1.1.2 主要试剂动物基因组DNA快速抽提试剂盒、琼脂糖购于生工生物工程(上海)有限公司；RPA核酸扩增试剂盒(TwistAmp®Basic Kit)购于南京纽帕斯生物科技有限公司；EmeraldAmp®MAX PCR Master Mix、DL2000 DNA maker及蛋白酶K购于宝生物工程(大连)有限公司；Omega HP Plant DNA Kit试剂盒、PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒购于鼎思(南京)生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 线虫种群和DNA提取 从全国不同地区采集病薯，采用浅盘法分离获得甘薯腐烂茎线虫(表1)。收集甘薯腐烂茎线虫放入1.5 mL离心管中，经5000 r/min离心10 min后，使用移液器尽量吸去管中的水，将离心管放入液氮中速冻30 s后，使用研磨杵进行研磨，研磨后的匀浆使用动物基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工)提取线虫DNA。南方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫、大豆胞囊线虫、禾谷胞囊线虫、贝西滑刃线虫、咖啡短体线虫等群体采用同样试剂盒提取DNA模板备用。所有供试群体均通过形态学和分子鉴定确认。

表1 供试线虫群体信息

表2 本文所用的引物及其序列信息

1.2.2 引物设计和检测 根据结果，从NCBI GenBank数据库中下载甘薯腐烂茎线虫核糖体ITS序列(GenBank No：EF210372)及其他植物寄生线虫ITS基因序列，进行多重比对分析，寻找序列中的特异性片段，设计引物进行合成。

RPA反应使用TwistAmp®Basic Kit，反应总体系为50 μl，首先在0.2 mL的PCR管中加入缓冲液29.5 μl，10 μmol/L的上游引物DD-RPAF和下游引物DD-RPAR(表2)各2.4 μl，DNA模板1 μl(～10 ng)，ddH2O 12.2 μl，用移液器吸打混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中，并用移液器混匀，最后加入280 mmol/L的MgAc溶液2.5 μl。将上述RPA扩增体系充分混匀，置于39 ℃的水浴或者金属浴孵育25 min，获得RPA扩增产物。将5 μl RPA产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像。

1.2.3 甘薯腐烂茎线虫RPA反应灵敏度检测 提取甘薯腐烂茎线虫的基因组DNA，采用Nanodrop2000 测定DNA浓度，再用水将其稀释成10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl。

分别以这5种不同浓度的甘薯腐烂茎线虫DNA为模板(1 μl)，以清水为阴性对照，参照1.2.2进行RPA反应并检测。

普通PCR以上述梯度稀释的DNA模板，扩增体系为25 μl，DNA模板1 μl，10 μM引物DdF1和DdR1(表2)各1 μl，EmeraldAmp®MAX PCR Master Mix(TaKaRa，大连)12.5 μl，ddH2O补足至25 μl，以清水为阴性对照，在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。PCR反应条件如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。将5 μl PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下观察。

1.2.4 单条甘薯腐烂茎线虫RPA反应灵敏度检测 挑取单条甘薯腐烂茎线虫，置于含有10 μl裂解缓冲液(8 μl ddH2O和1 μl 10×PCR buffer)的200 μl PCR管中，随后在液氮中冷冻2 min，65 ℃水浴2 min，重复3次，然后向PCR管中加入1 μl 10 mg/mL蛋白酶K，65 ℃温育1.5 h，95 ℃处理10 min，14 000 r/min离心1 min，获得单条甘薯腐烂茎线虫DNA模板(以100计)，并按10倍梯度依次稀释10-1、10-2、10-3和10-4条线虫DNA。以上述梯度的DNA模板进行RPA和PCR反应检测。

1.2.5 混合样本RPA反应检测 将20条甘薯腐烂茎线虫和50 mg甘薯薯块组织混合作为检测对象，阴性对照为不含甘薯腐烂茎线虫的甘薯薯块组织。甘薯腐烂茎线虫和植物组织(甘薯薯块组织)混合样本DNA提取采用Omega HP Plant DNA Kit试剂盒。

将100条腐烂茎线虫和250 mg自然状态下土壤混合作为检测样本，阴性对照为不含甘薯腐烂茎线虫的土壤。腐烂茎线虫和土壤混合样品的DNA提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒。

1.2.6 田间病样检测 采集6个罹病甘薯薯块样本和4个罹病薯块周围土壤，分别采用Omega HP Plant DNA Kit试剂盒和PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒提取DNA备用。采用RPA法和普通PCR法对DNA样本进行测定，以未发病薯块DNA样本和土壤作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 RPA引物特异性检测

将5 μl RPA产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像；引物DD-RPAF、DD-RPAR扩增后，甘薯腐烂茎线虫群体能稳定获得230 bp特异性片段，而南方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、贝西滑刃线虫、咖啡短体线虫等群体无特异性条带(图1)，表明该引物可特异性扩增甘薯腐烂茎线虫样本。

2.2 甘薯腐烂茎线虫群体基因组DNA 的RPA反应灵敏度检测

提取甘薯腐烂茎线虫基因组DNA，采取10倍梯度稀释，通过RPA和PCR 2种方法检测其灵敏度。当样本最大稀释至10-2ng/μl时，2种方法能够分别扩增产生约230和495 bp的特异性条带，样本进一步稀释均无扩增条带产生，表明 RPA技术与普通PCR检测的灵敏度相当，检测限约为10-2ng/μl(图2)。

2.3 单条甘薯腐烂茎线虫RPA反应灵敏度检测

提取单条甘薯腐烂茎线虫基因组DNA，采取10倍梯度稀释，通过RPA和PCR 2种方法检测其灵敏度。实验结果显示，样本最大稀释至100倍时，2种方法能够分别扩增产生约230 和495 bp的特异性条带，样本进一步稀释均无扩增条带产生，表明RPA技术与普通PCR检测的灵敏度相当，检测限约为1/100条线虫(图3)。

2.4 混合样本RPA反应检测

对甘薯腐烂茎线虫—薯块组织和线虫—土壤混合样本分别进行RPA反应检测，结果显示，存在甘薯腐烂茎线虫的混合样本都能产生特异性条带，而在仅有薯块组织和土壤的样本中无特异性条带产生(图4)。实验结果证明，RPA技术可用于甘薯腐烂茎线虫的田间检测。

2.5 田间病样检测结果

田间检测结果显示，RPA检测法和PCR检测法基本一致，6个病薯中均检测到甘薯腐烂茎线虫。但在病薯根际土壤中部分样本，RPA和PCR检测法均未检测到该线虫(表3)。这可能是由于土壤中线虫数量较少，提取模板浓度较低导致的。

3 讨 论

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种新兴的恒温核酸扩增技术，在病害诊断过程中越来越受到关注[21]。本文建立了甘薯腐烂茎线虫RPA检测方法，使用特异性的RPA引物(DD-RPAF/DD-RPAR)在39 ℃的恒温条件下，25 min即可完成DNA快速扩增。前人的研究表明，在37～42 ℃恒温条件下，RPA反应在60 min内可以产生10亿个DNA拷贝[22]，相比于普通PCR反应(2.5 h)和LAMP反应(1 h)，反应时间更短[23]。此外，RPA技术低温孵育取代了PCR的热循环模式，使该技术有望成为田间检测甘薯腐烂茎线虫一种行之有效的方法。

RPA技术的关键是筛选出特异性高的引物[24]，引物设计规则与PCR相似，但引物略长于PCR引物，引物碱基数介于30～38 bp之间时可以提高引物与重组酶结合的稳定性，更好地进行扩增反应[25-26]。在灵敏度检验中，一些研究发现RPA技术与PCR或real-time PCR反应相接近[27-28]。此外，某些RPA反应灵敏度被证实高于普通PCR反应[20,29]。本研究中，甘薯腐烂茎线虫RPA反应与PCR反应灵敏度一致，基因组DNA检出限约为10-2ng/μl，单条甘薯腐烂茎线虫检出限约为1/100条线虫。因此，该RPA引物可用于甘薯腐烂茎线虫的分子鉴定和病害诊断。为保证该方法检测可靠性和稳定性，本研究中利用设计的RPA引物对8个甘薯腐烂茎线虫群体和7种形态、生物学特性相似的植物寄生线虫进行检测，结果显示，该RPA方法具有良好的特异性和稳定性。

在自然条件下，甘薯腐烂茎线虫往往寄生于植物组织或者土壤中，许多自然条件下样本中都含有目标以外的各种杂质，特别是土壤中，含有数以万计的微生物和有机肥料等物质[30]。土壤中的多种微生物与环境的相互作用，DNA提取过程中一些腐殖质及土壤中许多未知因素都可能严重影响对目标线虫的检测。本研究建立的RPA方法不仅可以从群体gDNA和单条线虫DNA检测到甘薯腐烂茎线虫，而且还可以从病薯组织或病薯根际土壤中检测到甘薯腐烂茎线虫，省去了传统的形态学鉴定和PCR检测方法所需的从样本中分离目标线虫的步骤，简化了检测过程，节省了检测时间。

表3 样品检测结果

4 结 论

实验结果表明，RPA技术是一种耗时短、灵敏度高、稳定性强的甘薯腐烂茎线虫分子鉴定技术。本研究建立的RPA检测方法可用于甘薯腐烂茎线虫检测诊断，对甘薯茎线虫病的现场检测、早期诊断和指导科学施药具有重要意义。