聚乙烯醇纳米复合水凝胶促进感染创面愈合的作用研究*

丁燕锋，胡 皓，陈正荣，高 明△，贺茂林△

（1.广西医科大学广西生物医药协同创新中心 广西－东盟重大疾病防治协同创新中心，南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

近年来随着抗生素的滥用，细菌逐渐出现耐药性[1]。同时，由于血药难以有效抵达创面部位，导致口服和静脉抗生素对皮肤感染创面的治疗效果欠佳[2]。常见敷料如脱脂棉纱布不能保持伤口湿润，同时刺激瘢痕形成[3]。通过观察家猪伤口的愈合，Winter[4]提出了“湿润伤口愈合理论”，认为湿润环境伤口愈合更快。然而，伤口湿润易引起感染，如何保持伤口湿润并抑制病菌生长是值得探讨的问题。为解决该问题，一系列的抗菌水凝胶被开发。Ito 等[5]在聚乙烯醇(PVA)水凝胶中搭载磺胺嘧啶；Zhou等[6]在聚二烯丙基二甲基氯化铵复合水凝胶中搭载Ag/AgCl；Montaser等[7]在无纺布织物上填充海藻酸钠溶胶，同时搭载烟酰胺；Monerris 等[8]在肼改性聚乙烯醇（PVANN）水凝胶中搭载纳米。不同于以往的工作：独立于水凝胶外搭载抑菌物，本课题通过改性PVA并与具有抑菌效果的铜离子（Cu2+）交联[9]，从而将CuCl2锁定在水凝胶中并缓慢缓释，简化了抑菌水凝胶的制备。本研究旨在分析PVANN+CuCl2水凝胶的抑菌活性及促进感染创面愈合的能力，为感染创面的临床治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 动物与病菌 清洁级SD 大鼠6 只，体重180～220 g，5 日龄SD 大鼠2 只，均购自广西医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（桂）2020-0004。饲养环境：通风良好，环境清洁，室温20～25 ℃。金黄色葡萄球菌购自鲁微生物。

1.2 主要试剂与仪器 PVA购自Mackin；二甲基亚砜（DMSO，99.9%）、N,N’-羰基二咪唑（CDI）、氘代DMSO和三硝基苯磺酸（TNBS）均购自Sigma；水合肼购自天津富宇；二水氯化铜（CuCl2•2H2O）购自天津博迪；透析袋（截流分子量3500）和噻唑蓝（MTT）均购自Solarbio；细胞培养基购自Gibco；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青；活死细胞染液购自ThermoFisher Science。傅立叶红外仪产自PerkinElmer；核磁共振仪产自Bruker；电子显微镜产自Tescan，VEGA3；显微镜产自Olympus。

1.4 PVANN 的合成 称取1.5 g PVA 充分溶解于30 mL DMSO 中。干燥下称取8 g CDI 迅速加入上述溶液，摇床震荡8 h。然后量取8 mL 80%水合肼，加入前述反应体系，继续摇床震荡24 h。最终反应溶液用透析袋透析3 d，每6 h 换透析液1 次。透析后，将透析袋内产物（PVANN）冻干。PVA也用同样的方法透析并冻干。

1.5 TNBS 检测肼基 PVA 和PVANN 分别分散于超纯水，浓度为5%（w/v）。各自取溶液100 μL置入8连管中后加入5%TNBS水溶液5 μL，用移液枪吹打混匀后，静置1 h，观察颜色变化。

1.6 红外表征 分别称取50mg 冻干PVANN 和冻干PVA，压成致密柔软薄片，使用红外光谱仪检测500～4 000 cm-1波长范围的红外吸收光谱。

1.7 核磁共振表征 分别称取20mg PVA 和PVANN，分散于400 μL 氘代DMSO 后加入核磁管内。核磁共振仪测试35～165 ppm 的13C 核磁共振谱。

1.8 水凝胶的物理交联 水凝胶定义为PVA 和PVANN 与CuCl2溶液充分混匀后静置交联30min，然后倒置3min，液体没有流落视为凝胶，否则为溶液。预先配制30%（w/v）PVA 和PVANN 水溶液以及0.5 mol/L CuCl2水溶液。取500 μL 的PVA 和PVANN 水溶液，加入20 μL 0.5 mol/L CuCl2充分混匀，静置30 min后倒立3 min，观察溶液滑落情况。

1.9 交联水凝胶的扫描电镜 浓度及混合方法同1.8，将各自交联30 min 后的混合物冻干后切取薄片，粘于导电胶后喷金，扫描电镜观察微观结构。

1.10 体外抑菌实验 涂布法将200 μL含金黄色葡萄球菌（1×106CFU/mL）的生理盐水均匀涂布在固体LB 培养基上，并划分4 个区域，分别加入PVA 溶液、PVA+CuCl2溶液、PVANN 溶液、PVANN+CuCl2溶液。37 ℃培养12 h后观察菌落生长情况。

1.11 细胞毒性检测 用MTT 法检测改性材料的细胞毒性。提取5日龄SD大鼠骨髓间充质干细胞，将其传代至P3 代后种植于96 孔板（8000 个细胞/孔），分为6 组，每组设3 个复孔，分别加入10 μL PBS、PVA、PVANN、PVA+CuCl2、PVANN+CuCl2、DMSO（阳性对照）。继续培养24 h 后除去培养液，PBS清洗3遍，加入0.5 g/L MTT培养液100 μL。继续培养4 h 后小心吸去上清培养液，烘箱烘干后加入100 μL DMSO，摇床震荡30 min后用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度值。同时，用活死细胞染色验证材料对干细胞的毒性。将软骨细胞种植于爬片上并用同样的方法处理细胞，PBS清洗爬片，避光将其浸入含有Calcein-AM 和PI 的PBS 中孵育10 min。PBS冲洗3遍后置于载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞活死情况。

1.12 复合水凝胶感染创面实验 取180～220 g SD 大鼠6 只，随机分为3 组。2.5%戊巴比妥钠约0.3 mL腹腔注射麻醉，电动剃刀将大鼠背部毛发剃除。用手术刀在大鼠背部剥离直径约1.5cm的皮肤缺损，在缺损处用纱布涂布含金黄色葡萄球菌（1×106CFU/mL）的生理盐水，完成伤口感染模型。涂抹菌液后，在3 组大鼠伤口上分别覆盖生理盐水、PVA+CuCl2混合物、PVANN+CuCl2混合物。5 d 后观察伤口愈合情况。

2 结果

2.1 TNBS检测肼基团 肼基能快速与TNBS发生颜色反应[10]，使溶液从黄色变为红色。而羟基不能显色，从而检验肼基团是否接枝成功。混匀并孵育1 h后，可见PVANN能与TNBS发生颜色反应，使溶液从黄色变为明显的红色，而未改性的PVA组则未见颜色变化，说明本合成方法成功将肼功能团枝接到PVA上，见图1。

图1 用5%TNBS检验5%PVA和PVANN时的颜色变化

2.2 水凝胶的红外表征 经过红外表征可见PVANN 在1699 cm-1出现强吸收峰，应归为C=O。符合预期的反应设计，说明肼基团成功通过脂键枝接于聚乙烯醇上，见图2。

2.3 水凝胶的13C 核磁共振表征 对PVA 及PVANN 进行13C 核磁共振表征，PVANN 在158.5 ppm出现信号峰，归属为桥接肼基团和PVA主链的脂键的碳原子，见图3。

图2 改性前PVA（下）和改性后PVANN（上）的红外吸收光谱

图3 改性前PVA（下）和改性后PVANN（上）的13C核磁共振谱

2.4 水凝胶的物理交联 PVANN 和CuCl2在反应30 min 后，倒置3 min 混合物仍能粘附于瓶底而不滑落。而PVA 和CuCl2在反应30 min 后，倒置后滑落。说明经肼基团改性的PVANN 能与CuCl2充分交联形成水凝胶，见图4。水凝胶从玻璃瓶中取出，可见柔软、有粘性的水凝胶，见图5。

图4 充分交联后玻璃瓶内水凝胶形成情况

图5 充分交联后水凝胶的特征

2.5 冻干水凝胶的微观形态 电镜可见PVA 呈石棉样丝状，而在PVANN 中可见其微观结构为海绵状。在加入氯化铜进行交联后，其交联程度明显增加，空泡大小减小。说明PVANN 能有效交联形成网络，见图6。

2.6 水凝胶的体外抑菌作用 单纯PVA和PVANN周围未见抑菌圈形成，底部有小菌落形成；含CuCl2的PVA 迅速流动覆盖大片培养基，其底部没有菌落，周围未见抑菌圈，说明其具有抑菌作用，但无法固定在原位；经CuCl2交联的PVANN 被固定于原位，且周围可见明显的抑菌圈，见图7。

图6 电镜观察PVA、PVANN和用CuCl2进行交联的PVA-Cu、PVANN-Cu冻干后的结构（放大200倍，标尺：200 μm）

图7 体外抑菌实验

2.7 水凝胶的生物相容性 皮肤的修复依赖于干细胞的扩增和分化，对干细胞的毒性将影响创面的愈合。通常DMSO被认为具有较低的细胞毒性，与DMSO相比，PVA、PVA-CuCl2、PVANN、PVANN-Cu-Cl2的细胞毒性明显较低（P＜0.001）。尽管有重金属Cu2+的存在，但其对细胞的毒性远较DMSO 弱。活死细胞也得出了相似的结果，见图8。

2.8 复合水凝胶感染创面实验 5 d后观察伤口愈合情况，生理盐水处理的伤口和PVA覆盖的伤口未见明显愈合，伤口明显流脓，有血性液体渗出，伤口大小未见明显减小，并散发出恶臭气味。PVA-Cu覆盖的伤口，伤口轻度缩小，伤口表面少许脓痂。而PVANN-Cu 复合水凝胶覆盖的伤口未见脓性液体，伤口边缘虽然有红肿，但未见血性渗出物，亦无恶臭，伤口大小变小，见图9。

图8 复合水凝胶的生物相容性

图9 复合水凝胶在体抑菌情况

3 讨论

铜（Cu）是人体新陈代谢所必需的微量元素，成年人体内含100～150 mgCu，且每天需摄入3～5 mgCu才能维持新陈代谢平衡。Cu是铜酶催化所必需的，在造血、神经系统、组织修复、骨矿化等方面发挥重要作用。尽管过量Cu对人体具有毒性，但仍有较大的安全窗口区，通常超过人体需要量的100～150 倍时，可引起坏死性肝炎和溶血性贫血[11]。例如含Cu宫内节育器（IUD）利用Cu2+的抗生育作用而成为我国育龄妇女最广泛采取的避孕措施。Liu等[12]发现放置含Cu IUD不同年限妇女的宫颈粘液含Cu量可达（2.66±0.58）μg/g，但董白桦等[13]对放置IUD的妇女的子宫内膜进行检查，未发现对内膜上皮有明显毒害，同时运用PCR技术未发现含Cu IUD对子宫内膜有致癌作用。在本研究中，无论在MTT实验中还是在大鼠模型中均未发现含Cu水凝胶有明显毒性，这是由于伤口敷料仅需少量水凝胶即可覆盖伤口，并且绝大多数的Cu2+螯合于水凝胶中缓慢释放，并在缓释后浸润组织而稀释，因此对机体没有明显毒害。

本研究通过红外、碳谱、TNBS试验证明了肼基改性成功；溶液滑落试验证明了PVANN交联了Cu2+后具有凝胶力学特性；电镜观察冷冻水凝胶微观结构的变化，由PVA 的丝状结构变为PVANN 的泡沫状微观结构，可能是由于侧链枝接了较大分子，结晶性降低；通过MTT试验证明了含铜水凝胶的生物毒性小于DMSO；通过检测带菌固体LB 培养基上抑菌圈大小和动物感染模型创面状态验证了材料在体内、外均可抑制金葡菌的生长，从而抑制细菌生长对伤口修复带来的不利影响。本研究为临床创伤、感染的处理，减少抗生素的使用提供了新思路。