唐古特大黄根部土壤理化性质和微生物群落组成研究

刘汉成，孔照霞，隆雪萍，李保成，马小梅，扎西宗吉，刘 晶

(1.甘肃民族师范学院 化学与生命科学系，甘肃 合作 747000； 2.天祝藏族自治县人民医院，甘肃 天祝 733200;3.青海民族大学 生态环境与资源学院，青海 西宁 810007)

唐古特大黄(Rheumtanguticum)是蓼科多年生草本植物，因其根、茎中含有蒽醌类、鞣质类、萘类等化合物[1-2]，被广泛应用于医药行业，是临床常用药物之一。目前，唐古特大黄在青藏高原被广泛种植，对于带动农牧民脱贫致富效果显著。然而，在种植过程中，土壤质量下降或根腐病发生均导致唐古特大黄品质和产量降低。因此，研究不同生长年限唐古特大黄根部土壤理化性质和微生物群落变化状况，有助于了解土壤理化因子和微生物群落组成对唐古特大黄产量和品质的影响，进而推动中草药栽培产业的可持续发展。

土壤营养元素不仅影响药用植物的生长发育，同时也是构成药物有效成分的主要因子[3-4]。不同植物从土壤中获取营养元素的能力由自身因素和环境因素共同决定。从植物自身来讲，细胞膜的通透性及细胞膜上通道和蛋白质的分布数量和特性直接决定着植物吸收营养元素的能力，表现为对土壤中固有的某种或多种元素的利用效率不足，进而需要通过施肥满足植物对营养的需求[5-6]；环境因素如土壤pH值、温度、水分、营养元素存在的形式和微生物群落组成等，都会影响植物根系对营养元素的吸收利用能力[7-8]，进而影响栽培作物的产量和品质[9]。

土壤微生物对土壤肥力形成、土壤养分转化以及植物生长和病虫害防治均有重要作用[10]。土壤固氮菌对植物生长具有显著的促进作用，并且可以提高植株含氮量[11-13]；丁丽婧等[14]研究了微生物菌群对紫苏生长的影响，发现芽孢杆菌属菌株对紫苏生长有促进作用；仇有文[15]研究认为，土壤微生物总量与中药材白术的生物学产量之间呈正相关关系，即土壤中微生物数量越多，白术产量越高。但是，连作或多年生中药材会改变土壤理化性质，影响微生物数量及多样性，进而影响中草药的产量和品质[16-19]。研究认为，中药材连续种植会降低土壤肥力，进而会引起微生物群落结构简单化[20-21]。付丽娜等[22]研究结果也证实，中草药连作时，植物大量吸收了土壤中的有机质等营养物质，导致土壤中微生物群落结构简单，减弱了土壤微生物的代谢能力，从而影响中草药的栽培质量。另外，中药材根系分泌物也会对土壤微生物产生化感作用而影响其群落结构及功能[23-24]。但也有研究发现，怀牛膝连作可改善土壤环境，有利于植株生长，还能提高根部微生物代谢能力和多样性[25]。可见，不同种类的植物生长对土壤理化性质和根部土壤微生物的影响具有明显差异。目前，有关不同中药材与根部土壤微生物群落组成之间的关系已有较多报道，但截至目前，尚无关于唐古特大黄根部土壤理化性质和微生物群落组成方面的研究报道。鉴于此，研究不同生长年限唐古特大黄根部土壤理化性质和微生物群落组成，探索多年生唐古特大黄对根部土壤理化性质和微生物群落组成的影响，以助力唐古特大黄的产量提高和品质提升。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验土样于2019 年11 月20 日在甘南藏族自治州合作市门浪滩百草唐古特大黄种植基地采集，以未种植唐古特大黄的农田为对照(样点1)，以唐古特大黄生长1 a(样点2)、2 a(样点3)和3 a(样点4)为3个不同生长年限处理。用直径4 cm的土钻在对照样点用梅花五点取样法采集0～15、15～30、30～45 cm土层的土壤；在不同生长年限试验地内，随机选取5株唐古特大黄，用土钻采集根部0～15、15～30、30～45 cm土层的土壤；分别将每个样点相同土层的土壤样品混匀后带回实验室,立即进行土壤微生物分离(4 ℃保存不超过 24 h)、计数。

1.2 土壤理化性质测定

土壤含水量用烘干法测定，pH值使用pHS型酸度计测定，有机质含量采用重铬酸钾硫酸氧化-外加热法测定，全氮含量使用Kjeltec8200半自动定氮仪测定，全磷含量采用碱熔-钼锑抗比色法测定，土壤全钾含量采用碱熔-火焰光度法测定[26]。

1.3 土壤微生物数量测定

1.3.1 真菌数量 采用马丁氏培养基，以平板表面涂抹法计数[27]。即称取土壤鲜样10 g，在无菌条件下用无菌水配成不同稀释度悬浮液，取稀释度为10-2、10-3、10-4的土壤悬浮液各50 μL，接种于盛有灭菌马丁氏培养基的培养皿中，用无菌刮刀涂抹均匀。每个浓度3次重复，恒温(25 ℃)培养 5～7 d，选取每皿菌落数为 15～150 的稀释度统计菌落数，计算真菌数量。菌数(cfu/g)=菌落平均数×稀释倍数/干土质量。

1.3.2 放线菌数量 采用改良高氏一号培养基，以平板表面涂抹法计数。取稀释度为 10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液各50 μL接种于盛有灭菌改良高氏一号培养基的培养皿中，其余与真菌数量测定方法相同。恒温(28 ℃)培养 7～10 d，按上述方法和公式统计菌落数并计算放线菌数量。

1.3.3 细菌数量 采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，以平板表面涂抹法计数。取稀释度为 10-7、10-8、10-9的土壤悬浮液各50 μL接种于盛有灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的培养皿中，其余与真菌数量测定方法相同。恒温(28 ℃)培养 3 d 统计菌落数，按上述方法和公式统计菌落数并计算细菌数量。

1.4 数据分析及处理

采用SPSS 19.0软件对所测数据进行统计分析，用平均值±标准误表示测定结果，分别对相同生长年限不同土层深度处理、同一土层不同生长年限处理进行单因素方差分析，并用Duncan’s法对各测定数据进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 唐古特大黄根部土壤的理化性质

由表1可知，从不同样点对应土层来看，样点1各土层土壤含水量显著高于其他样点对应土层(P<0.05)，其他样点中各土层土壤含水量随着唐古特大黄生长年限增加而增加；样点2各土层土壤pH值显著高于其他样点(P<0.05)；样点1的0～15、15～30 cm土层有机质含量均显著大于其他样点，而样点2的0～15 cm土层有机质含量显著低于其他样点(P<0.05)，在种植唐古特大黄的样点中，有机质含量随唐古特大黄生长年限增加而增加；样点3土壤全氮含量最高，其次为样点4，样点2最低(P<0.05)；土壤全磷含量在样点4最高，其次为样点1，样点3最低；样点1各土层全钾含量均最高(P<0.05)，其他样点中全钾含量总体随着唐古特大黄生长年限增加而增加。

表1 唐古特大黄根部土壤中含水量、pH值、有机质、全氮、全磷和全钾含量

从每一样点的不同土层来看，样点1和3的30～45 cm土层含水量显著大于另外2个土层深度(P<0.05)，而其他2个样点各土层之间无显著差异(P>0.05)；除样点1的30～45 cm土层pH值显著小于15～30 cm土层外(P<0.05)，其他各样点各土层无显著差异(P>0.05)；除样点2的15～30 cm土层有机质含量显著大于另外2个土层以外，其余各样点中均表现为第1土层显著大于其他土层(P<0.05)；样点1和4的0～15 cm土层全氮含量均显著高于其他2个土层，样点2的15～30 cm土层全氮含量最高，样点3的30～45 cm土层全氮含量最高(P<0.05)；样点1的0～15 cm土层全磷含量最高，在样点2中各土层全磷含量无显著差异，样点3和4均表现为30～45 cm土层全磷含量最高；样点1的30～45 cm土层全钾含量最低，而0～15、15～30 cm土层全钾含量无显著差异，样点2各土层全钾含量无显著差异，样点3的15～30 cm土层、样点4的30～45 cm土层全钾含量显著高于其他2个土层(P<0.05)。

2.2 生长年限和土层深度对唐古特大黄根部土壤理化性质的影响

F测验(表2)表明，生长年限对唐古特大黄根部土壤含水量、pH值、有机质含量、全氮含量、全磷含量和全钾含量影响极显著(P<0.01)；土层深度对土壤含水量、有机质含量、全磷含量、全钾含量影响极显著(P<0.01)，而对pH值和全氮含量无显著差异；生长年限×土层深度对土壤有机质、全氮、全磷和全钾含量影响极显著(P<0.01)，而对含水量和pH值无显著差异。

表2 唐古特大黄根部土壤中含水量、pH值、有机质、全氮、全磷和全钾含量的方差分析

2.3 唐古特大黄根部土壤的微生物群落特征

从表3可以看出，唐古特大黄根部土壤中细菌数量最多，其次为放线菌，真菌数量最少。从三大类微生物在不同样点各土层的分布来看，0～15 cm土层，样点1的土壤细菌和放线菌数量显著大于其他样点，以样点4细菌数量最少，真菌数量则表现为样点3显著小于其他样点(P<0.05)，其他 3个样点无显著差异(P>0.05)；15～30 cm土层，细菌和放线菌数量仍然在样点1最多，其他3个样点间无显著差异，4个样点真菌数量无显著差异(P>0.05)；30～45 cm土层，细菌和放线菌数量表现为样点1极显著大于其他样点，细菌数量在样点2最少，放线菌数量在样点3最少，而真菌数量表现为样点3和4显著大于其他2个样点(P<0.05)。

从微生物在各样点的分布来看，样点1中，细菌数量随土层深度增加而逐渐减少，各土层间差异显著，15～30、30～45 cm土层中放线菌数量显著大于0～15 cm土层(P<0.05)，真菌数量在0～15、15～30 cm土层间无显著差异，但显著多于30～45 cm土层；样点2中，细菌数量分布与样点1相同，放线菌数量在3个土层间无显著差异，0～15 cm土层真菌数量最多；样点3中，细菌数量仍以0～15 cm土层最多，15～30、30～45 cm土层放线菌数量无显著差异，但显著高于0～15 cm土层，真菌数量在各土层间无显著差异(P>0.05)；样点4中，细菌和真菌数量在各土层间无显著差异，而放线菌数量以30～45 cm土层最多，显著大于0～15、15～30 cm土层(P<0.05)。

表3 唐古特大黄根部土壤微生物群落特征Tab.3 Characteristics of soil microbial community in the rhizosphere of Rheum tanguticum

2.4 生长年限和土层深度对唐古特大黄根部土壤微生物群落的影响

根据生长年限和土壤土层深度及二者共同作用对唐古特大黄根部土壤中细菌、放线菌和真菌数量的主体效应分析(表4)可知，生长年限对细菌和放线菌数量的影响极显著(P<0.01)，对真菌数量影响显著(P<0.05)；不同土层深度细菌和放线菌数量差异极显著(P<0.01)，而其对真菌数量无显著影响(P>0.05)；生长年限×土层深度对细菌和放线菌数量的影响极显著(P<0.01)，对真菌数量影响显著(P<0.05)。

表4 唐古特大黄根部微生物数量的方差分析Tab.4 Variance analysis on the soil microorganism quantity in the rhizosphere of Rheum tanguticum

2.5 唐古特大黄根部土壤理化性质与微生物群落相关性

由表5可知，唐古特大黄根部土壤含水量与土层深度呈显著正相关(P<0.05)；pH值与生长年限呈极显著负相关(P<0.01)，与含水量呈显著负相关(P<0.05)；有机质含量与生长年限呈显著负相关，与含水量呈显著正相关(P<0.05)；全氮含量与土壤有机质含量呈极显著正相关，而与pH值呈极显著负相关(P<0.01)；全磷含量与有机质含量呈极显著正相关(P<0.01)，与含水量呈显著正相关(P<0.05)；全钾含量与含水量、有机质含量、全氮含量呈极显著正相关，与pH值呈极显著负相关(P<0.01)；细菌数量与有机质、全钾含量呈极显著正相关(P<0.01)，与含水量呈显著正相关(P<0.05)，而与生长年限和土层深度呈极显著负相关(P<0.01)；放线菌数量与土壤含水量、有机质含量、全钾含量和细菌数量呈极显著正相关，但与生长年限呈极显著负相关(P<0.01)；真菌数量则与生长年限、全磷含量呈显著正相关(P<0.05)。

表5 唐古特大黄根部土壤理化性质与微生物数量Pearson相关性分析Tab.5 Pearson correlation analysis between physical and chemical properties and microbial quantity in soil of rhizosphere of Rheum tanguticum

续表5 唐古特大黄根部土壤理化性质与微生物数量Pearson相关性分析Tab.5(Continued) Pearson correlation analysis between physical and chemical properties and microbial quantity in soil of rhizosphere of Rheum tanguticum

3 结论与讨论

3.1 不同生长年限和土层深度对唐古特大黄根部土壤理化性质的影响

连续种植会改变土壤的理化性质，进而影响到栽培植物的品质和生产性能[20-21,28]。中草药大多为单品种连续种植，这种种植模式下土壤的理化性质较其他种植模式更容易改变。张向东等[29]、朱亚等[30]研究了商洛地区中药材种植地土壤理化特性，认为土壤中磷含量较高，但有机质、全氮和全钾等缺乏。路京等[31]比较了不同种植模式下杭白菊土壤理化性质，认为轮作的杭白菊根部土壤肥力和生物多样性均高于连作，有利于杭白菊高产。祖勒胡玛尔·乌斯满江[32]研究了连作和轮作对甘草种植地土壤理化性质的影响，认为连作模式土壤养分显著低于轮作模式。王娟英等[33]研究了不同连作年限怀牛膝土壤中元素含量的变化规律，发现怀牛膝连作会使土壤中大部分元素含量增加，而对全氮、全钾含量的影响不大。

从本研究结果来看，唐古特大黄根部土壤含水量随生长年限的增加呈上升趋势，可见，随着唐古特大黄生长年限的增加，土壤中有机质含量升高，土壤持水能力也加强。而土壤pH值除样点1外，随着唐古特大黄生长年限的增加而降低，说明唐古特大黄根系分泌物可有效降低土壤酸碱度；在种植唐古特大黄各样点内，随生长年限的增加，土壤有机质含量逐渐增加，这可能是pH值降低的原因[34]，这一现象在样点2表现明显，样点2有机质含量最低，其土壤pH值最高。除样点1外，土壤全氮含量在唐古特大黄生长2 a的样点3最高，样点4次之，样点2最低，其原因主要是样点2土壤质地贫瘠、营养元素匮乏，而样点3和样点4三个土层土壤全氮含量随生长年限增加表现为降低，说明植物在生长过程中吸收利用了土壤中的氮。全磷含量在样点4最高，这与朱亚等[30]、王娟英等[33]的研究结果一致，即随生长年限增加，磷元素含量增加。全钾含量随唐古特大黄生长年限增加也表现出增加趋势，这与前人研究结果[35-37]一致。

3.2 不同生长年限和土层深度对唐古特大黄根部微生物群落的影响

细菌、放线菌和真菌是土壤微生物的三大类群，一般而言，细菌数量最多，放线菌次之，真菌数量最少，但也有部分土壤中真菌数量多于放线菌[38]。如前所述，连作会影响土壤理化性质，而中药材由于多年种植其根部分泌物的增加会改变土壤理化性质，进而引起土壤生物分布及数量的变动，尤其是对环境变化敏感的微型生物[39]。土壤微生物的变化是造成连作障碍的主要原因[40]，王茂胜等[41]分析了不同连作年限植烟土壤中微生物群落动态，发现随着连作年限增加，土壤中细菌数量显著减少，而真菌和放线菌数量显著增加；而在怀牛膝连作10 a和30 a的土壤中，微生物总量增长，表现出怀牛膝连作的促进作用[33]。从本研究结果来看，唐古特大黄根部土壤中细菌数量>放线菌数量>真菌数量，与前人研究结果一致。从生长年限来看，细菌数量随生长年限的增加而减少，而放线菌和真菌数量显著增加，这与王茂胜等[41]的研究结果一致。从微生物的垂直分布来看，除放线菌外，细菌和真菌数量均随土层深度的增加而减少，与前人研究结果一致[42-44]，这主要是由于表层土壤中充足的营养和氧气以及适宜的温湿度条件更有利于微生物生长繁殖[45]。本研究中放线菌的数量随土层深度增加而增加，原因尚不明确，可能是唐古特大黄根部分泌物对该类群的影响所致。

3.3 唐古特大黄根部土壤理化性质对微生物群落的影响

不同植物根部对土壤或表现为促进作用，或表现为抑制作用[46-47]。单品种作物连作会消耗土壤中的营养元素，减少土壤微生物的营养来源，致使土壤微生物群落结构简单化，甚至降低微生物数量[20,22]。而郝慧荣等[48]认为，怀牛膝连作10 a、20 a甚至30 a以上，土壤理化性质均有所改善，微生物群落结构也趋于复杂。本研究中，从唐古特大黄根部土壤理化性质和微生物群落相关性来看，土壤中细菌和放线菌数量与唐古特大黄生长年限呈极显著负相关，而真菌数量与生长年限呈显著正相关，说明种植唐古特大黄对土壤中细菌和放线菌有一定的抑制效应，而对真菌生长有促进作用。当然，微生物数量随唐古特大黄生长年限增加而下降可能也与该种植基地的施肥策略有关，在该基地，唐古特大黄种植前施油渣为基肥，种植幼苗后不再施肥直至收获。