铁皮石斛黄酒工艺优化及其抗氧化活性的研究

周美玲，张志勇，张 川，梁金平，黄萍萍，江 巍

(福建省龙岩市农业科学研究所,福建 龙岩 364000)

石斛酒能强筋壮骨、舒筋活血、祛风除湿,是能显著提高铁皮石斛附加值的深加工产品之一,市场前景广阔。但目前铁皮石斛酒大多是用高度白酒炮制铁皮石斛干品制得,鲜见低度炮制铁皮石斛酒,也没有出现发酵型的铁皮石斛低度酒产品。因此,如果能研究开发出铁皮石斛低度酒则将能很好地弥补以上不足。黄酒是中华民族的传统酒,属于低度酿造酒,其保健养生功能历来备受推崇。《本草纲目》详细记载了69种可以治疗疾病的药酒,均以黄酒制成。就是在科学技术发达的今天,许多中药仍以黄酒泡制,借以提高药效[7]。随着人们生活水平的不断提高,消费者的需求目标已向健康保健方向转变,单纯的酒种已不能满足消费者的需要，因此，在生产过程中添加功能因子后制成的一类黄酒——功能性黄酒应运而生。目前,有关功能性黄酒产品的研发报道已涉及低聚糖黄酒、珍珠黑米养生酒、人参黄酒、冬虫夏草加饭酒[8]、桑葚黄酒[9]、莲子黄酒[10]、苦荞黄酒[11]、玫瑰茄黄酒[12]等,鲜见铁皮石斛黄酒的研究报道。

本研究从创新铁皮石斛的深加工产品入手,结合市场对低度、保健型黄酒的需求,以福建客家米酒这种具有地方特色的黄酒的传统生产工艺为基础,优化了以冠豸山铁皮石斛和黄酒为原料制得发酵型铁皮石斛黄酒的工艺，创制了富含铁皮石斛有效成分的新型的功能性保健酒，可为铁皮石斛的深加工提供一种可行方式,从而延长铁皮石斛的产业链。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

材料:糯米,为市售产品。铁皮石斛“福斛1号”(闽认药2016001),由福建省龙岩市农科所种植基地提供。酒曲:为福建连城客家黄酒甜酒曲。试剂盒:粗多糖含量测定试剂盒、DPPH·清除能力试剂盒、·OH清除能力测定试剂盒由苏州科铭生物技术有限公司提供。

1.2 主要仪器与设备

仪器:Synergy H1型多功能微孔板检测仪，为美国BioTek Instruments公司的产品;MIRCOCL 17R离心机，由德国Thermo Electron LED GmbH Am Kalllberg公司生产;AX205DR型分析天平，为瑞士METTLER TOLEDO公司的产品;S402消解仪，由山东海能仪器有限公司生产；P.O Box 10/100/200/1000移液枪，为芬兰万塔Thermo Fisher Scientific Ratastie 2公司的产品;发酵小酒坛,为陶制产品，25 L;蒸饭车;酒精计。

1.3 试验内容与方法

1.3.1 铁皮石斛黄酒的生产工艺流程 其生产工艺流程见图1。

图1 铁皮石斛黄酒的生产工艺流程

1.3.2 铁皮石斛黄酒酿制的操作要点 (1)铁皮石斛的预处理:将采收的铁皮石斛鲜条于通风处干燥48 h,洗净后拍碎,以确保铁皮石斛的有效成分能更充分地溶出；再将拍碎的石斛茎段切成2 cm左右的小段,沥干水。(2)浸米:选取米粒洁白、大小均匀、无杂质的糯米,用清水洗净，然后将糯米完全浸没在水中，浸泡12 h；然后用淋水冲净,控干水分。(3)蒸饭:用纱布包裹糯米，将其置于蒸饭车蒸格上并加入适量水,定时蒸40 min。蒸好的饭粒要求疏松均匀,具有弹性,熟而不烂,内无白心。(4)冷却:先用少量的山泉水淋饭，使之冷却，然后再摊饭冷却,冷却到饭温30 ℃左右。(5)拌曲:在洗净的酒缸中先撒入少许酒曲,然后松散地放入糯米饭,并将酒曲和经处理的新鲜石斛茎段均匀拌入饭内,搭成凹形圆窝,面上洒少许酒曲,盖上纱布。(6)发酵:将盖好纱布的酒缸缸口封严,置于温度为28 ℃左右的室内发酵,在主发酵阶段的前期开耙搅拌3次,以排除发酵中产生的二氧化碳和其他杂气,同时通入新鲜空气,有利于酵母菌的生长繁殖。在主发酵阶段结束后,加入适量的山泉水,将发酵坛放入18 ℃的空调房后再发酵20 d左右,以改善黄酒的风味[13]。(7)压榨、过滤:在发酵结束后,先把布口袋用冷水洗净,拧干水,再将发酵好的料装入袋中,用压榨机挤压去渣。(8)煎酒：将滤液静置澄清2～3 d,然后取上层清液,在80 ℃下通蒸汽保温20 min,以杀灭酒液中的酵母和细菌,并使酒中的沉淀物凝固而进一步澄清,也让酒体成分得到固定[13]。(9)灌装:待黄酒澄清后,将澄清酒液灌装入玻璃瓶,封口。

1.3.3 铁皮石斛添加量对铁皮石斛黄酒品质的影响 在固定酒曲用量、主发酵时间、料水比的条件下,考察不同铁皮石斛添加量(0%、5%、10%、15%、20%)对铁皮石斛黄酒的粗多糖含量、产酒率和感官评分的影响。

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1.3.4 酒曲用量对铁皮石斛黄酒品质的影响 在主发酵时间、料水比、铁皮石斛添加量相同的条件下,考察不同酒曲用量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)对铁皮石斛黄酒的酒精度的影响。

1.3.5 主发酵时间对铁皮石斛黄酒品质的影响 在料水比、酒曲用量、铁皮石斛添加量相同的条件下，考察不同主发酵时间(3、5、7和9 d)对铁皮石斛黄酒酒精度和感官评分的影响。

1.3.6 料水比对铁皮石斛黄酒品质的影响 在主发酵时间、酒曲用量、铁皮石斛添加量相同的条件下,考察不同料水比(1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2)对铁皮石斛黄酒产酒率和感官评分的影响。

1.3.7 铁皮石斛黄酒发酵工艺的正交试验优化 在单因素试验的基础上,以铁皮石斛添加量、酒曲用量、主发酵时间、料液比为试验因素,每个因素设置3个水平,利用L9(34)正交试验[14],以粗多糖含量及感官评价为指标,确定最佳的发酵工艺。正交试验各因素的水平设置见表1。每个处理3个重复。

表1 正交试验因素的水平设置

1.4 相关指标的测定方法

1.4.1 感官评分标准 取灌装封口后10 d的铁皮石斛黄酒成品,选酒厂10名具备品酒经验的人员，采取百分制对铁皮石斛黄酒进行感官品质评分,取平均分为该样品酒的得分。感官评价标准见表2 。

表2 铁皮石斛黄酒的感官评价标准

1.4.2 酒精度的测定 铁皮石斛黄酒酒精度的测定参照GB/T 13662─2018《黄酒》国家标准规定方法[15]。

1.4.3 粗多糖含量的测定 利用水提醇沉法提取粗多糖:吸取0.2 mL上清,慢慢加入0.8 mL无水乙醇,混匀后在4 ℃下静置过夜；再以10000 g的转速离心10 min,弃上清,向沉淀中加入1.0 mL 水,充分混匀，以溶解沉淀。

采用多糖含量测定试剂盒测定粗多糖：以葡萄糖作为对照品,在标准条件下进行测定，得到的回归方程为y=7.981x-0.0037,R2=0.9973,其中x为葡萄糖含量(mg/mL)；y为吸光值。

多糖含量(g/L)=(A+0.0037)÷7.981×V1÷V2×V3×1000=0.6265×(A+0.0037)，其中V1为醇沉后重新溶解后的体积(1 mL);V2为进行醇沉的体积(0.2 mL);V3为提取时加入水的体积(1 mL)。

1.4.4 铁皮石斛黄酒抗氧化性测定 DPPH·清除能力的测定:以Trolox作为对照体系,按苏州科铭生物技术有限公司的DPPH·试剂盒说明书进行测定。DPPH·清除能力(μmol/mL)=(△A+0.0081)÷0.7072=1.414×(△A+0.0081)，其中△A为吸光值差值。

·OH清除能力的测定:按苏州科铭生物技术有限公司的·OH清除能力测定试剂盒说明书进行测定。·OH清除率D(%)=(A测-A对)÷(A空-A对)×100%，其中A空、A对、A测分别为空白管、对照管和测定管的吸光值。

1.5 统计分析

采用DPS软件包对本试验数据建立数据库,完成单因素方差分析、正交试验设计及统计分析。数据经过3个重复,以平均值±SD表示。显著性差异检验使用邓肯氏新复极差检验法。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛添加量对铁皮石斛黄酒品质的影响

不同铁皮石斛添加量(0%、5%、10%、15%、20%)对铁皮石斛黄酒品质的影响见表3。由表3可知：随着铁皮石斛添加量的增加,铁皮石斛黄酒的多糖含量也显著提高,当添加量达到糯米质量分数20%时,粗多糖含量可达到2.66 g/L,比对照空白黄酒的多糖含量提高了138%,这说明铁皮石斛渗入黄酒发酵可显著提高黄酒中的粗多糖含量。产酒率试验发现铁皮石斛的加入对其影响不显著。感官评分结果显示：随着铁皮石斛添加量的增加,石斛酒的口感愈发醇和并带有石斛的粘绵感；但当铁皮石斛添加量提高到20%时,铁皮石斛黄酒口感发苦,醇和度降低,感官得分低于80分。因此,铁皮石斛的添加量宜控制在15%以下。

表3 铁皮石斛添加量对铁皮石斛黄酒品质的影响

2.2 酒曲用量对铁皮石斛黄酒品质的影响

不同酒曲量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%) 对铁皮石斛黄酒品质的影响见表4。当酒曲量为0.2%、0.4%时,铁皮石斛黄酒的酒精度低,酒味淡薄。这是因为所加酒曲糖化力较低,影响酒的质量。当酒曲量为0.6%、0.8%、1.0%时,铁皮石斛黄酒的酒精度较高,其中加曲量为0.8%时最好。感官得分在加曲量为0.2%～0.8%时处于上升趋势,尔后下降。因此,酒曲用量应该控制在1.0%以下。

表4 酒曲用量对铁皮石斛黄酒品质的影响

2.3 料水比对铁皮石斛黄酒品质的影响

如表5所示：铁皮石斛酒的产酒率随着加水量的增大而逐渐上升；在料水比为1∶1.0时,感官得分最高；当料水比为1∶1.2时,口感开始变差,这可能是因为加水量的增大使铁皮石斛黄酒中乙醇、糖类及香味物质的浓度变低,导致酒体变得淡薄。因此,料水比宜控制在1∶1.0以下。

表5 料水比对铁皮石斛黄酒品质的影响

2.4 发酵时间对铁皮石斛黄酒品质的影响

从表6可以看出：随着主发酵时间的延长,糯米淀粉在各种微生物的作用下生成醇类、醛类及芳香族化合物,还原糖转化成酒精,酒精度升高；但发酵时间过长会使铁皮石斛黄酒出现酸败现象,使之出现苦、酸、涩味,感官得分也随之降低。因此,主发酵时间控制在7 d左右较适宜。

表6 发酵时间对铁皮石斛黄酒品质的影响

2.5 正交试验结果分析

根据正交试验的极差分析结果(表7)和方差分析结果(表8),铁皮石斛添加量、主发酵时间、料水比这3个因素对黄酒粗多糖含量的影响均达到了极显著水平，其主次顺序为:铁皮石斛添加量>发酵时间>料水比>酒曲用量；理论最优组合为A2C3D2B1。

铁皮石斛添加量、料水比这2个因素对感官评价得分的影响均达到了极显著水平。影响感官评价得分的因素的主次顺序为:铁皮石斛添加量>料水比>发酵时间>酒曲用量；理论最优组合为A2D2C2B1。

由表7可见．在铁皮石斛黄酒的酿造过程中,研究中所设的考察指标要想同时获得最佳水平,4个因素在优化组合时并不一致。在实际生产时,主发酵时间取7 d可节省酿造时间成本,故权衡得到铁皮石斛黄酒酿造的最佳工艺条件组合A2D2C2B1,即铁皮石斛添加量为10%,酒曲添加量为0.6%,料水比为1∶1.0,主发酵时间为7 d,再经20 d的后发酵。按照该工艺生产的铁皮石斛黄酒的粗多糖含量为1.93 g/L,较传统黄酒提高了72.3%,且口感醇和爽口,感官评分为90.2分。

表7 铁皮石斛黄酒主发酵工艺的正交试验结果与分析

表8 各指标的方差分析结果

2.6 铁皮石斛黄酒抗氧化性能的评价

DPPH自由基是一种稳定的深紫色自由基,在517 nm处有最大吸光值；当其从能够释放质子的物质处得到质子时,会形成一种稳定的反磁性分子,其在517 nm处的吸光值会变小。释放质子是物质抗氧化的机理之一,通过测定物质对DPPH自由基的清除能力,可以较迅速地评价物质的抗氧化能力[16]。采用DPPH法,以Trolox作为对照体系，量化铁皮石斛黄酒的抗氧化能力试验结果(图2)发现:铁皮石斛黄酒和传统黄酒均具有明显清除DPPH的能力,且黄酒清除DPPH的能力随着铁皮石斛添加量的增加几乎呈线性上升趋势，这说明在酿造过程中添加铁皮石斛有效成分可显著提高黄酒的DPPH清除能力,这可能与铁皮石斛黄酒中融入了传统黄酒所没有的铁皮石斛多糖有关。

图2 铁皮石斛黄酒清除DPPH自由基和·OH的能力

从图2中还可以发现：·OH清除率随着铁皮石斛添加量的增加而降低,铁皮石斛的加入使之在羟自由基清除率方面表现不如传统黄酒,这可能是因为铁皮石斛渗入黄酒酿造过程中发生的复杂生化反应影响了铁皮石斛黄酒的抗氧化性能。

3 结论

以铁皮石斛为辅料,通过渗入糯米全发酵生产铁皮石斛黄酒,以粗多糖含量和感官评定得分为评价指标，得到的最佳发酵工艺条件为:铁皮石斛添加量10%,酒曲添加量0.6%,料水比1∶1.0,于28 ℃左右发酵7 d；再经20 d的后发酵。在此条件下制得的铁皮石斛黄酒的粗多糖含量为1.93 g/L,较传统黄酒提高了72.3%,且酒液呈橙黄色,具有黄酒独特的风味和铁皮石斛的天然风味,口感醇和爽口,感官评分为90.2分。

抗氧化性研究结果表明：铁皮石斛黄酒对DPPH·的清除率随铁皮石斛添加量的增加而上升；但铁皮石斛黄酒对羟自由基(·OH)的清除率比传统黄酒低。