黄丝藻提取物及2 种微藻多糖的抑菌活性分析

刘 哲，张 莉，李润植，崔红利

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

自20 世纪40 年代以来，人们从海洋生物中发现许多抗细菌和抗真菌的物质，但是多数研究都集中在大型海藻，关于微藻抑菌活性的研究仍然较少[1]。与大型海藻相比，微藻培养条件、生物量、微藻种质纯度等都能较好控制，微藻培养更易在实验室进行，具有很强的潜在工业生产价值[2]。

常见的人工抗菌方式是喷施化学农药和生物农药，化学农药残留多，对土壤、河流和生物链中的生物会造成不可逆转的危害。生物农药多是利用生防菌物质做杀菌剂，成本高，易产生二次危害。已有研究表明，微藻提取物含有某些有效成分，具有一定的杀菌效果，可以直接用于抑制某些细菌和真菌的生长，亦可用作刺激物诱导植物产生对病原菌的抗性，增强植物抵抗病菌能力。例如，微藻体内的脂类、多糖类、酚类、萜类、含硫化合物、卤化物等，对革兰氏阳性菌、真菌具有良好的抑菌效果[3]。不同藻类的萃取物对不同菌的抑菌效果不同[4-6]。已有研究从常见的小球藻、螺旋藻、盐藻[7]、蓝藻[8]等具有抗污染、抗逆能力强、生长速度快等特性的微藻中筛选出抑菌物质[9]。

黄丝藻（Tribonemasp.）是一种丝状微藻，它在淡水及海水中均能快速繁殖，适应力极强。对黄丝藻的研究大多集中在黄丝藻引起的污染治理的方法探究方面[8]。有研究表明，黄丝藻的主要代谢产物包含有机酸、氨基酸、醇类、糖类等物质[10]。紫球藻（Porphyrodium cruentum）胞外多糖具有很强的抗氧化性，并且对细菌的生长具有一定的抑制作用[11-13]。

本试验主要研究黄丝藻水提物、5 种有机试剂提取物以及黄丝藻多糖和紫球藻胞外多糖对于大肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、涅斯捷连科氏菌、海杆菌、盐单胞菌6 种受试菌种的抑菌效应，旨在为研制高效生物抑菌剂提供科学参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试微藻黄丝藻（Tribonemasp.） 和紫球藻（Porphyrodium cruentum）来源于山西农业大学分子农业与生物能源研究所。

1.2 试验方法

本试验微藻培养方式为一次培养，用BG11 培养基培养黄丝藻，将生长至对数期的微藻悬浮液经7 000 r/min 离心8 min，弃去上清得藻泥，所得藻泥加适量蒸馏水洗涤2～3 次，冷冻干燥后获得黄丝藻干藻。用人工海水培养基培养紫球藻，在其生长至对数期收集藻液，离心后的上清液用于胞外多糖的制备。

1.2.1 提取物的制备

1.2.1.1 水提物的制备 采用反复冻融法[14]提取。黄丝藻藻泥冷冻干燥后，用液氮反复研磨3 次得黄丝藻藻粉。称取5 g 黄丝藻藻粉，加入10 mL 蒸馏水，置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min。冻藻粉经室温融解5 min，再研磨，反复6 次。加入蒸馏水至体积达100 mL，60 ℃水浴1 h 后，在6 000 r/min 下离心10 min，收集上清液并真空干燥得水提物。收集的水提物用灭菌水复溶，过0.22 μm 的水相除菌膜，置于已经灭菌的1.5 mL 离心管中，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.1.2 不同溶剂提取物的制备 采用浸提法[15]。称取2 g 黄丝藻藻粉，加入40 mL 各有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇/甲苯（体积比3∶1）），摇匀2 h。样品经5 000 r/min 离心10 min，获得上清液。有机提取物经真空浓缩至浸膏后冷冻干燥至粉末。将有机提取物用二甲基亚砜充分溶解，然后过0.22 μm 的有机相除菌膜，置于已经灭菌的1.5 mL 离心管中，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 抗生素的配制 精确称取100 mg 青霉素溶于1 mL 灭菌水中，并过0.22 μm 的水相除菌膜，置于已经灭菌的1.5 mL 离心管中，作为阳性对照保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.3 黄丝藻多糖的制备 按照陈静[16]的方法提取黄丝藻多糖，并稍作修改。称取烘干的黄丝藻干藻10 g，用4%氢氧化钠料液比1∶20（m/V）充分混合后，于80 ℃水浴3 h。加入200 mL 的20%三氯乙酸溶液，充分混匀后放在4 ℃冰箱中静置过夜。样品经5 000 r/min 离心5～10 min，取上清液加3 倍体积95%乙醇，4 ℃冰箱中静置过夜。5 000 r/min 离心5～10 min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤1 次，用真空干燥箱80 ℃干燥后得黄丝藻多糖固体。用研钵充分研磨黄丝藻多糖，溶于灭菌水中，过0.22 μm的水相除菌膜，置于已经灭菌的1.5 mL 离心管中，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.4 紫球藻胞外多糖的制备 按照孙利芹[17]的方法提取紫球藻胞外多糖。

1.2.5 抑菌试验

1.2.5.1 受试菌种及培养基 本试验受试菌为大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、涅斯捷连科氏菌（Klebsiella nesterensis）、盐单胞菌（Halomonas）、海杆菌（Maris bacilli）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌种均来自于山西农业大学分子农业与生物能源研究所。

1.2.5.2 抑菌试验方法 所有菌种从-80 ℃冰箱中取出解冻后，取200 μL 菌种于5 mL 培养基中扩培，再于100 mL 锥形瓶中扩培12 h。

采用稀释法[18]，并进行改良。用15 mL 离心管装5 mL 培养基，每管分别加30 μL 已经制备好的水相提取物及有机相提取物，再加5 μL 对应的菌种。其中，大肠杆菌需要再加5 μL 卡纳抗生素。置于培养箱中培养12 h 后进行OD 值的测定（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌37 ℃，其他菌种30 ℃），并设置空白对照（不加提取物）作为阴性对照。以上所有操作需在无菌条件下进行。所有试验操作重复3 次。

1.3 数据分析

数据采用Mictosoft Excel 2010 进行统计分析；采用Origin 9.1 软件绘图；采用SPSS 18.0 软件进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 提取物对大肠杆菌的抑制作用

从图1 可以看出，与大肠杆菌的阴性对照相比，紫球藻胞外多糖对大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用，其他7 种提取物对大肠杆菌的生长均无明显影响。

2.2 提取物对盐单胞菌的抑制作用

由图2 可知，与盐单胞菌的阴性对照相比，黄丝藻的水提物与紫球藻胞外多糖促进了盐单胞菌的生长。黄丝藻多糖对盐单胞菌生长的影响并不明显。黄丝藻的甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇/甲苯（体积比3∶1）提取物对盐单胞菌的生长均具有明显抑制作用，其中，乙醇提取物对盐单胞菌生长的抑制作用最强。

2.3 提取物对解淀粉芽孢杆菌的抑制作用

由图3 可知，与解淀粉芽孢杆菌的阴性对照相比，黄丝藻丙酮提取物与黄丝藻多糖对解淀粉芽孢杆菌生长的影响并不明显。黄丝藻的甲醇提取物、乙醇提取物、甲醇/甲苯（体积比3∶1）提取物和紫球藻胞外多糖对解淀粉芽孢杆菌的生长均具有一定的抑制作用，但并不显著。黄丝藻的水提物、乙酸乙酯提取物对解淀粉芽孢杆菌生长具有显著的抑制作用。

2.4 提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用

由图4 可知，与金黄色葡萄球菌的阴性对照相比，黄丝藻水提物和紫球藻胞外多糖对金黄色葡萄球菌的生长无明显影响。黄丝藻多糖、黄丝藻的甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇/甲苯（体积比3∶1）提取物对金黄色葡萄球菌生长具有显著的抑制作用。

2.5 提取物对涅斯捷连科氏菌的抑制作用

由图5 可知，与涅斯捷连科氏菌的阴性对照相比，黄丝藻的甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇/甲苯（体积比3∶1）提取物均促进了涅斯捷连科氏菌的生长。黄丝藻水提物、黄丝藻多糖和紫球藻胞外多糖对涅斯捷连科氏菌的生长具有显著的抑制作用。

2.6 提取物对海杆菌的抑制作用

由图6 可知，与海杆菌的阴性对照相比，黄丝藻甲醇提取物、乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇/甲苯（体积比3∶1）提取物均对海杆菌生长具有积极的作用。黄丝藻水提物、黄丝藻多糖和紫球藻胞外多糖对海杆菌的生长具有一定的消极作用。

3 结论与讨论

近年来，关于微藻提取物的研究越来越多，但是主要集中在小球藻、螺旋藻、紫球藻等比较常见的微藻[19]。用不同的化学试剂提取微藻所得的活性物质，其活性成分不同，抑菌效果和种类也有差异[20]。罗爱国等[21]用冻融法和回流法提取了7 种可食藻的活性成分，将其水提物和醇提物应用于7 种食品致病菌，结果表明，其中6 种藻类的提取物对供试菌种均有一定的抑制作用。席波等[22]研究表明，海水小球藻、螺旋藻、紫球藻等10 种微藻多糖对4 种细菌和真菌的生长均有明显的抑制作用。江红霞等[23]研究发现，4 种微藻提取物对3 种植物病原菌都具有一定的抗菌活性。

有研究表明，这是相似相溶的原理[24]，不同的有机溶剂萃取出与其相似的活性物质，而不同的活性物质可能具有不同的抑菌效果。以往研究表明，微藻提取物具有抗菌的效果，微藻提取物可用于制备高效、安全的生物抑制剂。从微藻中提取出的具有抗菌效果的活性物质，可进一步开发成新的药物或用于农业生物防治的更安全的化合物，同时也可解析微藻与其他微生物的相互作用机制[25]。本研究表明，黄丝藻中具有多种抑菌性能较强的水溶性物质及可溶于有机试剂的活性物质，黄丝藻多糖及紫球藻胞外多糖均可用于制备活性较强的生物抑菌剂。

本研究首先用浸提法获得了黄丝藻的6 种提取物并提取了2 种微藻多糖。其次，通过提取物对6 种受试菌种生长活性影响的比较，明确了黄丝藻提取物以及黄丝藻和紫球藻多糖对6 种细菌的生长分别具有一定的抑制作用，尤其是黄丝藻的有机试剂提取液对金黄色葡萄球菌的抗菌活性很明显；黄丝藻水提物及2 种微藻多糖对涅斯捷连科氏菌的抗菌活性最强。但具体的抗菌有效活性成分还不明确，需要进一步的分离、鉴定研究。