益生木质纤维素对鸡盲肠黏膜免疫屏障的影响

温 曌，武笑天，杨 玉

（山西农业大学动物科学学院，山西太谷030801）

家禽生长由于受环境（如热应激、有害气体刺激）和营养应激等因素的影响，很容易损伤肠道屏障，导致肠道黏膜病变，抵抗力下降，造成肠道菌群失衡紊乱进而引发各种疾病进而降低其生产性能，甚至导致死亡[1]。目前，蛋鸡集约化养殖日粮特点为高能量、高蛋白、低纤维，这种营养特点也导致了肠炎问题。而膳食纤维被营养学界认定为第七类营养素，它能够改善许多慢性肠道炎症疾病，在参与调节机体免疫功能中占据着重要地位。有研究表明[2]，代谢性炎症的形成是由于过度营养摄入和新陈代谢所导致体内炎症因子和内毒素水平的升高，可增强多种炎症分子的表达和活性，增加血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的表达。益生木质纤维素是由奥地利开发的一种由新鲜木材为原料制备而成的木质纤维素，作为高质量的日粮纤维应用于动物营养中[3]。跟传统纤维来源相比，益生木质纤维素是可发酵和不可发酵膳食纤维的同源混合物。总膳食纤维（TDF）88%，其中，粗纤维含量为59%，可溶性膳食纤维含量为1.3%，中性洗涤纤维（NDF）含量为78%，酸性洗涤纤维（ADF）含量为64%，木质素含量为25%～30%，这类纤维可以发挥日粮纤维的最大功效。由于其纤维含量极高，添加较低水平的益生木质纤维素（1.0%～1.5%）就能够对家禽的消化过程产生积极影响[4]，增加经济回报9%以上。因此，在家禽日粮中添加益生木质纤维素可以保持能量和营养水平的平衡，而不需要对饲料配方进行重大调整。张庆茹等[5]研究表明，日粮中添加菊粉能显著提高雏鸡的胸腺免疫器官指数。LING 等[6]研究表明，高的粗纤维水平可降低雏鹅空肠绒毛高度，提高盲肠绒毛高度与隐窝深度之比。FAN 等[7]研究发现，猪饮食中补充15%黏性瓜尔豆胶（GG）或可溶性膳食纤维高直链玉米抗性淀粉（RS）可以促进IL-10mRNA 的表达，但不会增加促炎细胞因子TNF-a和IL-6mRNA 的表达，从而达到保护结肠、减少结肠炎发生的目的。

目前，国内外对盲肠黏膜免疫屏障影响的研究主要对啮齿类动物、猪和人进行了探讨，但是针对鸡的研究鲜有报道。本试验通过添加不同水平的益生木质纤维素，研究其对不同品种鸡盲肠组织形态、黏液层厚度、盲肠相关炎症基因表达的影响，以评价益生木质纤维素和品种对2 种鸡盲肠黏膜免疫屏障的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选取9 周龄、体质量相近的健康边鸡和伊莎褐鸡各108 只。益生木质纤维素（OptiCell）(批号：17000461) 由北京九州互联农牧科技有限公司提供，总膳食纤维（TDF）含量为88%，其中，粗纤维含量为59%、可溶性膳食纤维含量为1.3%、中性洗涤纤维（NDF）含量为78%、酸性洗涤纤维（ADF）含量为64%、木质素含量为25%～30%。饲料原料购自山西太谷县石羊饲料公司。

1.2 试验设计

2017 年在山西农业大学动物科学学院科研工作站进行试验。采用2 因素3 水平试验因子设计，在育成期（9～20 周），按不同生长阶段的营养要求，自行配制益生木质纤维素含量不同、等能等蛋白的饲料（表1），益生木质纤维素含量设3 个水平（OF 组为对照，不添加益生木质纤维素，OL 和OH 组分别添加2%和4%的益生木质纤维素），各处理设6 个重复，每个重复6 只鸡。预试期1 周，正试期11 周。试验采用立体3 层笼养，每笼3 只鸡，自由饮水和采食，及时清粪，保证通风，其他均按常规方式饲养。

表1 9～20 周育成期饲料的营养成分

1.3 测定指标及方法

在试验第20 周末，从每个重复选1 只与相应处理平均体质量相近、禁食12 h 的鸡，空腹称质量。口腔放血宰杀后剥离肠道，称法氏囊、脾脏、胸腺免疫器官质量。将左盲肠段放入固定液中固定，其余盲肠段转入-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.1 免疫器官指数的计算 免疫器官指数＝免疫器官质量（g）/雏鸡活质量（g）×100%。

1.3.2 盲肠结构组织形态测定 将盲肠样品固定于4%多聚甲醛4 h，按照常规方法制作病理石蜡切片，脱水、固定、HE 染色，最后在显微镜下观察其变化，每张组织切片选择绒毛完整无损且走向直的5 个视野来测定绒毛高度和隐窝深度。用Image-Pro Plus 软件测量绒毛高度等，取平均值。

1.3.3 盲肠黏液层厚度测定 将右盲肠段放入Carnoy 固定液和无水甲醇中固定，且4 ℃存储。待进行石蜡包埋后通过阿利新蓝- 过碘酸雪夫试剂（AB-PAS）进行染色。切片经AB-PAS 染色之后，酸性黏液物质呈蓝色，糖原、中性黏液物质呈红色，混合性黏液物质呈蓝紫色或紫蓝色[8]。在普通光镜下，用Image-Pro Plus 软件测量各组黏液层的厚度，每个标本随机选取5 处，测定黏液层厚度，取平均值。

1.3.4 盲肠免疫基因表达测定 用Trizol 试剂提取盲肠总RNA，检测RNA 浓度。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，以合成的cDNA 为模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明，在实时荧光定量PCR 仪上进行，反应条件为：预变性95 ℃30 s，变性95 ℃5 s，共50 个循环，退火60 ℃34 s；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。将β-actin 作为本试验的内参基因，采用2－ΔΔCt法计算TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1、MUC2mRNA 相对表达量。利用Primer-BLAST 设计引物，合成引物如表2 所示。

表2 目的基因引物序列

1.4 数据分析

使用SPSS 17.0 统计软件对所有试验数据进行处理，按2 因素3 水平试验设计分析品种、添加水平的主效应和交互作用，采用F检验进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 益生木质纤维素与不同品种对免疫器官指数的影响

由表3 可知，不同品种对脾脏指数、法氏囊指数无显著影响（P＞0.05），但对胸腺免疫器官指数有极显著影响（P＜0.01），且边鸡胸腺免疫器官指数极显著高于伊莎褐鸡。益生木质纤维素对脾脏、胸腺、法氏囊免疫器官指数均无显著影响（P＞0.05）。品种和益生木质纤维素交互作用对脾脏、胸腺、法氏囊免疫器官指数的影响均不显著（P＞0.05）。

表3 益生木质纤维素和不同品种对免疫器官指数的影响

2.2 益生木质纤维素和不同品种对盲肠组织形态的影响

表4 益生木质纤维素和不同品种对盲肠组织形态的影响

由表4 可知，不同品种对绒毛高度（V）、隐窝深度（C）和绒隐比（V/C）均无显著影响（P＞0.05）。益生木质纤维素对V 和V/C 均无显著影响（P＞0.05），但对C 有极显著影响（P＜0.01），且OL 和OF 组极显著低于OH 组（图1）。品种和益生木质纤维素交互作用对V、C 和V/C 无显著影响（P＞0.05）。

2.3 益生木质纤维素和不同品种对盲肠黏液层厚度的影响

由表5 可知，不同品种和益生木质纤维素对黏液层厚度均有极显著影响，伊莎褐鸡盲肠黏液层厚度极显著高于边鸡（P＜0.01），OL 组极显著高于OH组（P＜0.01）。品种和益生木质纤维素交互作用对盲肠黏液层厚度有显著影响，且伊莎褐鸡OL 组显著高于其他各组（P＜0.05）（图2）。

表5 益生木质纤维素和不同品种对盲肠黏液层厚度的影响

2.4 益生木质纤维素和不同品种对盲肠相关炎症基因、MUC2 的影响

从表6 可以看出，不同品种对MUC2 mRNA 相对表达量有极显著影响（P＜0.01），伊莎褐鸡的MUC2 mRNA 表达量极显著高于边鸡。添加益生木质纤维素对IL-1、TNF-α、IL-10、IL-6、MUC2 mRNA 相对表达量有显著影响，OL 和OH 组促炎性细胞因子IL-1mRNA 相对表达量显著低于OF 组（P＜0.05），OL 和OF 组促炎性细胞因子TNF-α mRNA 相对表达量极显著低于OH 组（P＜0.01），OL 组IL-10mRNA 相对表达量极显著高于OF 组（P＜0.01），OL 组IL-6mRNA 相对表达量显著低于OF 组（P＜0.05），OL 组MUC2 mRNA 相对表达量极显著高于OH 和OF 组（P＜0.01）。不同品种和益生木质纤维素交互作用对TNF-α 和MUC2mRNA 相对表达量有显著影响，伊莎褐鸡TNF-α mRNA 相对表达量OH 组极显著高于其他各组（P＜0.01），且边鸡TNF-α mRNA 相对表达量最小，伊莎褐鸡MUC2mRNA 相对表达量OL 组极显著高于其他各组（P＜0.01）。

表6 益生木质纤维素和不同品种对盲肠IL-1、TNF-α、IL-10、IL-6、MUC2 mRNA 相对表达量的影响

3 结论与讨论

脾脏、胸腺、法氏囊是家禽重要的免疫器官，参与体液免疫和细胞免疫，在禽类健康中占有重要的作用，其发育状态及机能强弱决定着机体的免疫水平，所以，脾脏、胸腺、法氏囊质量可以作为评价禽类免疫机能强弱的重要指标[9]。法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官，可产生B 淋巴细胞进而产生特异性抗体，完成特异性免疫应答，因此，法氏囊指数可作为反映鸡免疫机能的重要指标之一[10]。有研究表明，在雏鸡饲粮中添加一定比例的低聚木糖能够提高雏鸡免疫器官指数，增强雏鸡的免疫机能[11-12]。HUANG 等[13]研究发现，在日粮中添加不同剂量的壳聚糖能够促进肉鸡免疫器官的发育。本研究表明，20 周边鸡胸腺免疫器官指数高于伊莎褐鸡，说明边鸡的免疫机能相对好于伊莎褐鸡。20 周高纤维组对脾脏、胸腺和法氏囊免疫器官指数有增加的趋势，说明添加益生木质纤维素增强了鸡体免疫机能，与前人[11-13]的研究一致。

肠道黏膜屏障在畜禽生长发育中占有重要作用。肠黏膜组织结构的完整性是衡量肠免疫功能的重要指标[14]。肠绒毛受损时，短而宽，出现不完整和断裂、脱落的结构[15]。肠隐窝是肠道上皮细胞分化发育的关键场所，合理的隐窝深度是肠黏膜健康的标志。当肠道炎性疾病发生时，肠隐窝深度会加深，因此，绒隐比（V/C）能够反映肠黏膜形态结构及功能的整体状况[16]。谢燕娟等[17]研究了稻壳粉、苜蓿草粉、羊草粉对成年鹅肠道组织形态变化的影响，发现稻壳粉显著提高了成年鹅十二指肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度，显著提高空肠绒毛高度和绒毛高度与隐窝深度的比值；不同纤维源对十二指肠和空肠长度影响差异不显著，稻壳粉组回肠长度显著高于苜蓿草粉组与羊草粉组。章学东等[18]研究发现，日粮中添加适量的苜蓿草粉，能够增加蛋鸡的大小肠、盲肠长度和绒毛高度，增加盲肠内大肠杆菌和乳酸杆菌数量。刘记强[19]以苜蓿草为纤维源饲喂固始鸡，结果表明，鸡肠道绒毛高度增加或呈增加趋势，隐窝深度变浅。本研究表明，9～20 周OL组对盲肠V/C 没有显著影响，20 周边鸡OF、OL 和OH 组V 均相应高于伊莎褐鸡，但差异不显著，表明20 周边鸡对营养物质的吸收能力高于伊莎褐鸡，说明边鸡肠道组织形态功能较伊莎褐鸡好，这与前面20 周边鸡的免疫性能比伊莎褐鸡好结果一致。

黏液层是一个动态屏障，通过杯状细胞不断分泌黏液[20]。黏液是肠粘膜免疫系统的一部分，对于防御病原物的入侵有着重要意义。MAHESH 等[21]研究表明，与无菌（GF）对照组相比，给小鼠添加富含膳食纤维的日粮可增强小鼠结肠黏液层厚度。本试验结果表明，20 周伊莎褐鸡的盲肠黏液层厚度显著高于边鸡，说明伊莎褐鸡的肠道机械屏障功能高于边鸡，能够更好地抵制有害物质的入侵。但是，对于边鸡而言，添加益生木质纤维素盲肠黏液层厚度均高于对照组，是否与边鸡因缺乏纤维使肠道菌群因为饥饿而“吃”黏液，导致了20 周伊莎褐鸡C 值也极显著低于边鸡，也间接的说明了边鸡耐粗纤维的能力较伊莎褐鸡强，有待进一步研究。另外，边鸡和伊莎褐鸡OL 组黏液层厚度分别高于对照组和高纤维组，表明低纤维组可更好的防御病原微生物的入侵，保持肠道健康，这与之前OL 组可改善盲肠组织形态结构的研究一致。

黏液层是肠黏膜的首要屏障，黏液的主要成分黏蛋白由肠上皮中杯状细胞分泌。因此，黏蛋白MUC2 表达量可作为评价肠道健康状态的重要指标之一[22]。黏蛋白是黏液层的主要成分，黏液层越厚，表明黏蛋白越多。张莉[23]研究表明，微晶纤维素（是一种发酵性能低且黏度低的纤维）显著降低盲肠黏蛋白2（MUC2）和紧密连接蛋白-1（ZO-1）的mRNA 表达。本研究表明，20 周OL 组提高了盲肠MUC2mRNA 表达水平，伊莎褐鸡和边鸡OL 组均有助于保持机械屏障，这与前面黏液层厚度的研究一致，推测OL 组可通过增加黏液层厚度来增加杯状细胞分泌黏蛋白MUC2 含量。

肠道各类细胞因子是肠道免疫屏障的重要组成部分。各种促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子之间的协同作用是是调节机体炎症发展的关键。张莉[23]研究表明，仔猪日粮中添加菊粉和果胶可以显著提高结肠紧密连接蛋白-1（ZO-1）的表达，显著降低回肠IL-1β、盲肠TNF-α 的表达；菊粉可以显著降低回肠TNF-α 的表达、有降低盲肠IL-8 和提高IL-10含量的趋势。本试验表明，20 周低水平益生木质纤维素组降低了促炎性细胞因子IL-1的分泌水平，增加了抗炎性细胞因子IL-10的分泌水平。这与前面20 周低纤维组显著增加黏液层厚度的研究一致。20 周IL-10水平增加促进MUC2水平的分泌，这与前人研究一致，IL-10能够抑制炎症反应发生，促进杯状细胞分泌黏蛋白。试验同时发现，伊莎褐鸡和边鸡OL 组均可有效抑制促炎性细胞因子的分泌，表明低纤维组可以通过增强肠道体液免疫功能，增强盲肠肠道免疫屏障，维护肠道健康。

综上所述，添加低水平（2%）益生木质纤维素提高了伊莎褐鸡和边鸡的免疫器官指数、改善了盲肠组织形态结构及盲肠黏液层厚度，并抑制促炎性细胞因子的产生，提高抗炎性细胞因子的表达，减缓了肠道炎症的发生。