醉鱼草内生细菌ZJ1 生防机制初探

马东丽，刘晓峰，任 璐，周建波，殷 辉，赵晓军

（山西农业大学植物保护学院，山西太谷030801）

植物内生细菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的一类内生菌，其广泛存在于寄主植物的各个部位中，且可以长期稳定的在植物体内定殖[1-2]。研究发现，植物内生细菌可以产生与寄主植物相同或者相似的活性物质，起到抗肿瘤[3]、杀虫[4]、抑菌、抗氧化[5]、降糖[6]等作用。随着绿色农业的发展，植物内生细菌已成为一种不可或缺的生防资源，受到研究者们的重视。

近年来，研究者们对植物内生细菌在生物防治方面的应用进行了大量研究。OZAKTAN 等[7]证明了黄瓜内生细菌在具有较好抑菌活性的同时还有促生作用，可促进种子萌发和植株的生长。PAVLO 等[8]研究发现，IMBG290 在抑制病原真菌的同时也可促进马铃薯的发育。另外，有研究者对植物内生细菌的抑菌及促生机制进行了研究，发现内生细菌可通过产生蛋白酶、几丁质酶[9]和纤维素酶[10]等实现抑菌作用，通过分泌IAA[11]、生物固氮[12]、具有溶磷能力[13]等实现促生作用。李凤芳[14]研究发现，番茄立枯病的生防菌株B11-4 可以产生IAA 和嗜铁素，证明菌株B11-4 主要通过产生促生物质和嗜铁素等物质来发挥抗病和促生作用。孔令春[15]研究发现，抗稻瘟病的拮抗细菌通过提高植株中的几丁质酶和POD 等与抗性相关的酶活性以及产生抗菌物质来发挥其诱抗、抑菌及促生作用。拮抗细菌对病原真菌的抑菌机制有多种，其中主要有抑制菌丝生长和孢子萌发、破坏分解细胞壁和细胞膜以及诱导植物产生抗性等，其产生的抗菌物质作为主要的抗菌机制已被广泛认可，其产生的挥发物已被证实在促生、抑菌[16-18]以及诱抗方面[19]发挥着重要作用。

醉鱼草（Buddleja lindleyanaFortune）是醉鱼草属马钱科的灌木，在我国分布广泛、生长迅速、容易种植，是一种天然的中药。在我国古代就常用作中药，因其有活血、祛风、杀虫等功效，可用来治跌打损伤、风湿麻木、风寒感冒、蛔虫和钩虫等疾病[20]。有研究证明，醉鱼草茎叶具有良好的抗病毒活性。蔡鲁[21]研究发现，醉鱼草具有较好的抗H5N1 病毒活性，对醉鱼草茎叶化学成分进行分离提纯，提取出6 种有明显抑菌作用的物质。目前尚未见醉鱼草内生菌的相关报道。本研究以醉鱼草内生细菌ZJ1为研究对象，对ZJ1 菌株的胞外蛋白酶、几丁质酶、β-l，3- 葡聚糖酶、纤维素酶活性及溶磷能力、产吲哚-3- 乙酸（IAA）能力进行测定，并通过测定番茄保护酶活性对ZJ1 菌株进行抑菌机制初探，以期为该菌株在生物防治方面的应用以及后期的市场化奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

醉鱼草内生细菌ZJ1 由山西农业大学植物化学保护实验室分离并保存；番茄种子为美国红将军（西安市西兰良种有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 胞外蛋白酶活力测定 将ZJ1 菌株接于酪蛋白培养基（取5 g 脱脂奶粉、1.50 g 琼脂分别溶于50 mL 蒸馏水中，灭菌后，待冷却至45～50 ℃，将两液混合均匀）上，重复3 次，在26 ℃霉菌培养箱中培养48 h 后，观察是否有透明圈产生。

1.2.2 几丁质酶活力测定 称取5 g 几丁质，加入20 mL 丙酮研磨，研磨过程中再加入适量丙酮，充分研磨至呈糊状，在4 ℃条件下边研磨边加入浓盐酸60 mL，用磁力搅拌器搅拌2 h，在4 ℃静置24 h。将混合物过滤，把滤液加入到预冷的50%乙醇中，经低温离心除去上清液，再加入预冷的无菌水，离心，除去上清液，如此反复多次至中性，收集沉淀，即制成胶体几丁质。

将ZJ1 菌株点接于几丁质培养基（称取胶体几丁质15 g，（NH4）SO41 g，酵母粉5 g，KH2PO41.4 g，MgSO·45H2O 0.3 g，琼脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 调至7.0。）上，每皿3 个接菌点，重复3 次，在26 ℃霉菌培养箱中培养48 h 后，观察是否有透明圈产生。

1.2.3 β-l，3- 葡聚糖酶活力测定 将ZJ1 菌株接于茯苓粉培养基（K2HPO417.98 g，KH2PO46.80 g，酵母膏5 g，茯苓粉4 g，苯胺蓝100 mg，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。）上，在26 ℃培养48 h 后，观察是否有透明圈产生。

1.2.4 纤维素酶（β-1，4 葡聚糖酶）活性检测 将ZJ1 菌株点接于羧甲基纤维素培养基（CMC-Na 5 g，MgSO·47H2O 0.10 g，（NH4）2SO40.50 g，K2HPO40.25 g，琼脂20 g，加蒸馏水至1 000 mL。）上，重复3 次，在28 ℃培养48 h 后，用1 mg/mL 刚果红染色20 min，再用1 mol/L 的NaCl 浸泡15 min，最后用水洗去表面附着的刚果红，观察菌周围是否有透明圈产生。

1.2.5 溶磷能力的测定 将ZJ1 菌株点接于蒙金娜培养基（葡萄糖10 g，（NH）42SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，FeSO40.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，CaCO35 g，卵磷脂0.20 g，酵母膏0.40 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值调至7.0）上，每皿5 个接菌点，重复3 次，置于28 ℃培养5 d 后，观察是否有溶磷圈产生。

1.2.6 吲哚-3- 乙酸活性检测 采用Salkowski 比色法测定吲哚-3- 乙酸（IAA），将ZJ1 菌株接种于YSP 培养液中培养12 h 后，取100 μL 菌悬液接入100 mg/μL 色氨酸的King 培养液（MgSO4·7H2O 1.50 g，K2HPO41.15 g，蛋白胨20 g，L- 色氨酸0.10 g，丙三醇15 mL，蒸馏水溶解后定容至1 000 mL，pH 调节至7.0）中，每三角瓶放50 mL 培养液，重复3 次，以加无菌水的培养液为对照，振荡培养12 d。分别取菌悬液和对照各5 mL 置于试管中，再加入5 mL 比色液，室温静置15 min，观察其颜色变化。若变红为阳性，表示ZJ1 菌株可以分泌生长激素IAA。

1.2.7 ZJ1 发酵液原液的制备 将ZJ1 菌株接种于YSP 培养液中，在28℃、160 r/min 恒温培养箱中培养12 h 后，以5%的添加量加入新鲜YSP 培养基中，恒温振荡培养3 d，即得到ZJ1 菌株发酵液。

1.2.8 对番茄植株防御酶活性测定 室温盆栽番茄，用清水培育至第4 片真叶出现时，挑选长势较为一致的幼苗，将ZJ1 发酵液原液和5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、80 倍、100 倍、200 倍的稀释液，每隔7 d 分别用20 mL 进行灌根处理，对照组为等量清水。每个处理重复3 次，40 d 后采集各处理番茄叶片20 g，置于-20 ℃冰箱备用。按照试剂盒操作说明书具体步骤通过比色法测定番茄叶片中CAT、MDA、PAL、POD、PPO、SOD 含量。

1.3 数据分析

试验数据均使用Microsoft Excel 2010 进行数据统计，使用SPSS25 进行分析，并用Origin 软件作图。

2 结果与分析

2.1 醉鱼草ZJ1 菌株胞外蛋白酶活力测定

由图1 可知，ZJ1 菌株在酪蛋白培养基上可以产生透明圈，说明醉鱼草ZJ1 菌株可产胞外蛋白酶。

2.2 醉鱼草ZJ1 菌株几丁质酶活力测定

由图2 可知，ZJ1 菌株在几丁质培养基上没有透明圈产生，说明醉鱼草ZJ1 菌株不产几丁质酶。

2.3 醉鱼草ZJ1 菌株β-l，3-葡聚糖酶活力测定

由图3 可知，ZJ1 菌株在茯苓粉培养基上没有透明圈产生，说明醉鱼草ZJ1 菌株不产β-l，3- 葡聚糖酶。

2.4 醉鱼草ZJ1 菌株纤维素酶（β-1，4 葡聚糖酶）活性检测

将ZJ1 菌株在CMC 培养基上培养48 h 后，先用刚果红染色，后用1 mol/L NaCl 浸泡，洗去附着在表面的刚果红后（图4），菌落周围有明显的透明圈产生，说明醉鱼草ZJ1 菌株可产纤维素酶。

2.5 醉鱼草ZJ1 菌株溶磷能力的测定

由图5 可知，在蒙金娜培养基上的ZJ1 菌落周边没有溶磷圈产生，说明醉鱼草ZJ1 菌株没有溶磷能力。

2.6 醉鱼草ZJ1 菌株吲哚-3-乙酸活性检测

由图6 可知，加入比色液后，ZJ1 菌液没有变色，所以，醉鱼草ZJ1 菌株不分泌IAA。

2.7 ZJ1 菌株发酵液对番茄叶片防御酶活性的影响

2.7.1 ZJ1 菌株发酵液对过氧化氢酶（CAT）活性的影响 由图7 可知，番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，叶片内CAT 活性均发生不同程度的变化，在ZJ1 菌株发酵液原液和稀释5 倍、100 倍的处理条件下，与对照相比CAT 活性显著升高，其中，稀释100 倍处理明显高于其他处理。

2.7.2 ZJ1 菌株发酵液对番茄叶片丙二醛（MDA）含量的影响 由图8 可知，番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，10 倍、50 倍、200 倍液处理的番茄叶片MDA 含量与对照相比变化较为明显，50 倍液处理含量显著低于对照，而200 倍液处理远高于对照和其他处理，其余处理叶片MDA 含量与对照相比无显著差异。

2.7.3 ZJ1 菌株发酵液对番茄叶片过氧化物酶（POD）活性的影响 由图9 可知，番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，各处理条件下叶片内CAT活性均有不同程度上升，5 倍稀释液处理对POD 活性的促进效果最好，远高于对照。

2.7.4 ZJ1 菌株发酵液对番茄叶片多酚氧化酶（PPO）活性的影响 由图10 可知，番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，叶片内PPO 活性均发生不同程度的变化，稀释10 倍、80 倍处理与对照相比，对叶片PPO 活性的促进效果最好，远高于其他处理。

2.7.5 ZJ1 菌株发酵液对番茄叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 由图11 可知，番茄叶片经不同倍数稀释液灌根培养后，SOD 活性均发生不同程度的变化，除稀释50 倍、200 倍ZJ1 发酵液处理外，其余各处理下的番茄叶片SOD 活性都明显高于对照，稀释5 倍处理最为显著。

3 结论与讨论

李雪婷[9]研究表明，生防菌株S17-377 可通过产生蛋白酶和几丁质酶发挥拮抗作用。千慧敏等[22]研究表明，生防细菌PA2101 可致使病原真菌菌丝畸形并抑制分生孢子萌发，且可产生蛋白酶、β-l，3-葡聚糖酶、纤维素酶以及几丁质酶，还可以分泌IAA 等多种抑菌及促生物质，并具有合成可对烟草病害进行防控的DAPG 和PCA 基因。任晶等[23]研究发现，解淀粉芽胞杆菌SQR9 可以产生IAA，促进黄瓜植株的生长。本研究表明，ZJ1 菌株可分泌胞外蛋白酶及纤维素酶，但不能产生几丁质酶、β-l，3- 葡聚糖酶以及IAA，且不具有溶磷能力。蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-l，3- 葡聚糖酶等胞外酶可抑制病原真菌的生长，是生防菌株发挥拮抗作用的重要保障，ZJ1 菌株虽不分泌几丁质酶、β-l，3- 葡聚糖酶以及IAA，不具有溶磷能力，但本研究及以往研究发现，ZJ1 菌株可产生抑菌活性物质，抑制菌丝生长及孢子萌发，纤维素酶和蛋白酶可分别降解纤维素和蛋白质，说明ZJ1 菌株可通过胞外蛋白酶及纤维素酶分解真菌菌丝结构，进而抑制菌丝生长。

CAT、MDA、POD、PPO、SOD 是植物抗病代谢过程中重要的几种酶，植物内生细菌不仅具有良好的生防作用[24]，还能改善防御酶系统，促进宿主植物的生长、增强抗逆[25]。本研究表明，ZJ1 菌株发酵液能提高番茄叶片的CAT、POD、PPO、SOD 的酶活性，降低叶片中MDA 含量，通过保持番茄植株膜系统的稳定，进而对植株起到防护效果，使之抗病性增强，减少植物病害发生。同样地，张妙宜等[26]分离内生细菌QN2MO-1 可促进番茄种子萌发和植株生长。焦蓉等[27]分离出内生细菌YN201728 菌株，发现其能够促进烟草种子的萌发及幼苗生长。但是不同菌株对各种酶活性的改善能力有很大差异，可能与菌株来源不同以及菌株在提高互作植物防御酶活性方面有关。总之，醉鱼草内生细菌ZJ1 菌株具有良好的生防效果，有待进一步通过大田试验进行测定。