人工繁养湘华鲮性腺发育的组织学研究

邹利，李传武，蒋国民，杨鑫，王金龙

（1.湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153；2.湖南省水产原种场，湖南 长沙 410153；3.湖南省水产高效健康生产协同创新中心，湖南 常德 415000）

湘华鲮Sinilabeo decorus tungting（Nichols）隶属鲃亚科Barbinae、华鲮属Sinilabeo，是湖南省特有的一种野生鱼类，在湘、资、沅、澧四水的中上游均有分布[1]。据调查，1996～2000 年湖南沅水流域湘华鲮年产量为7.60 t，2006～2010 年为0.85 t，2016～2018 年年产量仅剩0.1～0.2 t，湘华鲮种群数量急剧减少，资源现状已为濒危等级，列为沅水特有鱼类国家级水产种质资源保护区重点保护鱼类[2]。为保护开发利用野生湘华鲮资源，本课题组在湖南怀化和邵阳等地共收集野生湘华鲮400 余尾，进行人工驯养和繁殖。2011 年在国内首次成功繁育湘华鲮子一代20 余万尾，分别饲养于湖南省水产科学研究所（池塘）和洪江区横岩库区湘华鲮保育点（江河网箱）。目前，我国湘华鲮主要进行了人工繁殖、营养、生长及消化系统组织观察等研究[3-6]，而有关养殖湘华鲮的性腺发育及繁殖生物学的研究却未见报道。本研究通过观察池塘养殖的1～7 龄湘华鲮子一代性腺的组织切片，探究湘华鲮子一代性腺发育特征与规律，以丰富湘华鲮人工繁殖理论，为规模化养殖及资源增殖提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

2011—2017 年，本课题组经人工催产获得了湘华鲮苗种。1～7 龄湘华鲮子一代分批养殖于湖南省水产科学研究所池塘。于2018 年3 月7 日、4 月8日、4 月23 日和5 月3 日，分四次采集湘华鲮子一代，每次每年龄组采鱼4～6 尾，共计154 尾。

1.2 方法

测定实验鱼的全长、体质量，快速解剖，观察记录性腺的外形特征，称量性腺重，计算性腺指数（GSI）＝（性腺质量/体质量）×100%。取性成熟的雌性亲本测定绝对怀卵量。绝对怀卵量=（卵巢样品卵粒数/卵巢样品重）×卵巢重[7-9]。将性腺切割成小于1 m3的组织块（幼鱼性腺不用切割），组织块于波恩氏液中固定24 h。固定好的性腺组织块，经梯度酒精脱水，石蜡包埋切片（厚6～8 μm），HE 染色，最后树胶封片。Nikon 显微镜观察并摄影，采用Caseviewer 软件进行测微尺计量。实验数据用平均数±标准差（Mean±SD）表示[10]，采用Excel 2007 和SPSS 17.0 等软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 湘华鲮的生长与性腺发育

3—5 月，池塘养殖的不同年龄的湘华鲮性腺发育情况如下：1 龄湘华鲮性腺发育处于Ⅰ期末期；2龄湘华鲮性腺处在Ⅱ期；3 龄、4 龄湘华鲮的卵巢和精巢发育基本处于Ⅱ期～Ⅲ期，5 月上旬发现1 尾4 龄雄性的精巢发育至Ⅳ期；5 龄湘华鲮的卵巢处于Ⅲ期～Ⅳ期，5 龄雄性个体的性腺为Ⅳ期；6 龄、7龄个体均性成熟，在3 月卵巢处于Ⅲ期晚期～Ⅳ期早期，在4—5 月性腺为Ⅳ期卵巢或处于向Ⅴ期卵巢过渡的阶段（表1）。

在繁殖季节，性成熟的雌性湘华鲮性体指数可达10.97%，卵巢膨大，卵粒清晰可见，脉络清晰的血管覆在结缔组织被膜上（图版Ⅰ-1），发育到Ⅳ期晚期。成熟卵排出后，卵巢松弛、萎缩、大量充血，呈红色透明状，基本无卵粒残留（图版Ⅰ-3）。共采集到7尾性成熟雌湘华鲮，绝对怀卵量最少16 046 粒，最多29 127 粒，平均怀卵量为23 509 粒。性成熟雄鱼的性腺指数可达5.54%，精巢发育至Ⅳ期晚期，有精液排出，呈乳白色（图版Ⅰ-2）。精液排出后，精巢呈淡红色（图版Ⅰ-4）。

2.2 性腺的形态特征及分期

表1 1～7 龄湘华鲮在池塘养殖条件下的生长和性腺发育情况Tab.1 Growth and gonadal development of 1～7－year－old Sinilabeo decorus tungting cultured in a pond

湘华鲮的精巢成对分布在腹腔上方，大部分呈轴对称的细线状或棒状结构，偶见两边精巢大小存在明显差异。湘华鲮的卵巢同样成对分布在腹腔上方，大部分成对同形，早期呈细线状或扁平条状，成熟时膨大为棒状或长囊状。根据湘华鲮的性腺外形和组织切片观察结果，参考刘筠的分期标准[7]，湘华鲮的精巢和卵巢发育可分为6 个时期。

2.2.1 精巢发育的分期

Ⅰ期精巢呈透明的细线状，性腺被黑色的腹膜包裹，Ⅰ期的精巢和卵巢不能通过肉眼分辨。切片观察，精巢横切面为椭圆或扁圆形。精原细胞（Spermatogonium）零散分布于精巢基质中，细胞直径为8～15 μm，其细胞核中位，嗜碱性强，呈深紫色，细胞核直径为5～7 μm（图版Ⅱ-1）。

Ⅱ期精巢呈白色的细棒状，质地紧密，Ⅱ期精巢与卵巢可通过肉眼分辨。Ⅱ期精巢相比Ⅰ期精巢，精原细胞数量显著增加且排列成束，由支持细胞、血细胞等结缔组织细胞包裹，形成精小叶雏形。在3—5 月,鱼类生长较快，处在Ⅱ期的精巢也快速发育，精小叶快速增加，此时期支持细胞、红细胞也大量增加（图版Ⅱ-2、3）。

Ⅲ期精巢呈细棒状，白色，横切面呈扁圆形或三角形。Ⅲ期精巢开始出现多种类型的生殖细胞，生殖细胞以小叶腔为单位同步发育。初级精母细胞（Primary spermatocyte）由精原细胞分裂形成，圆形，细胞质为嗜碱性，细胞核染色深，细胞直径为3.4～4.6 μm，比精原细胞小。由初级精母细胞分裂形成的次级精母细胞（Secondary spermatocyte），平均细胞直径为2.29 μm，其细胞核的嗜碱性进一步增强，细胞质已经很少。此时期的精巢还有少量精原细胞和精子细胞（图版Ⅱ-4、5）。

Ⅳ期精巢呈中间浑圆，两端尖窄的棒状，乳白色，横切面为椭圆形或半圆形。到Ⅳ期末，用手挤压湘华鲮腹部，能从泄殖孔挤出少量白色的精液。此时期的生殖细胞主要由精子细胞（Spermatid）和精子（Spermatozoon）组成，同时也存在少量精原细胞及其他生精细胞。在普通光学显微镜下观察，小叶腔内的精子细胞和精子均呈一个染色很深的圆形；精子细胞平均直径为1.6 μm，精子头部平均直径为

0.9 μm（图版Ⅱ-6、7、8）。

Ⅴ期精巢柔软而膨胀，轻压腹部，大量乳白色的精子会流出泄殖孔。4 月下旬—5 月初，养殖湘华鲮的Ⅳ期精巢经人工催产能顺利过渡到Ⅴ期。此期大量精子呈游离状态分布于小叶腔，而小叶腔中间形成一个空腔并逐渐增大，同时也存在少量精原细胞及其他生精细胞（图版Ⅱ-9、10）。

Ⅵ期精巢为排精后的精巢，其血管更加明显而呈淡红色，其体积也因精子的排出而缩小，但本实验中雄鱼排出的精液量少，与Ⅴ期精巢的组织切片结果差异不明显。

2.2.2 卵巢发育的分期

Ⅰ期卵巢为白色透明的细线状，外形与Ⅰ期精巢相似。Ⅰ期卵巢晚期的生殖细胞为卵原细胞和第1 时相的卵母细胞。第1 时相卵母细胞的细胞核大，约占细胞的一半，核中部有1～3 个核仁，细胞直径13～42 μm，核径6～25 μm（图版Ⅲ-1），排列紧密，靠近卵巢壁的卵母细胞生长速度较快。

Ⅱ期卵巢为淡黄色透明的扁带状，卵巢开始出现肉眼可见的板层状结构，即产卵板，明显区别于Ⅱ期精巢。切片观察，Ⅱ期卵巢以第2 时相的卵母细胞为主，早期有少量第1 时相的卵母细胞，晚期开始有少量第2 时相的卵母细胞向第3 时相过渡。第2 时相卵母细胞由于胞质的增加，细胞体积快速增大，因此细胞相互挤压而呈不规则的多边形；细胞质嗜碱性，HE 染色呈深蓝色；细胞核也相应增大，核浅紫色，位于细胞中央；靠近核膜内侧分布着核仁，在同一切面核膜内侧有4～15 个核仁。第2时相卵母细胞处于初级卵母细胞的小生长期，细胞体积可增加60 倍以上，直径47～231 μm，核径25～94 μm（图版Ⅲ-2、3、4）。

Ⅲ期卵巢为浅黄色的带状，肉眼能见少量卵粒。卵巢扩大，分布于卵膜上方的血管较粗大。卵巢中以第3 时相的卵母细胞为主。与第2 时相卵母细胞相比，第3 时相的卵母细胞体积更大，染色较浅。第3 时相卵母细胞处于初级卵母细胞的大生长期早期阶段，细胞质中开始出现染成淡红色的小颗粒，即卵黄颗粒；细胞质的外缘先出现几层透明的小液泡；卵母细胞卵膜加厚，开始出现较薄的辐射带，平均厚度为1.4 μm。在质膜的外侧有一层扁平的滤泡细胞，其细胞核染色深，且呈扁平状。第3 时相卵母细胞体积显著增大，核仁数目增多，细胞直径165～489 μm，核径43～186 μm（图版Ⅲ-5、6）。

Ⅳ期卵巢呈黄色，体积继续膨大，卵巢膜内包裹着大量淡黄色卵粒。Ⅳ期卵巢以第4 时相卵母细胞为主，早期有少量第2、3 时相卵母细胞，而Ⅳ期末时第4 时相卵母细胞占切片上卵数的85%以上，占切片面积的96%以上，且卵径大小比较整齐、发育趋于同步。第4 时相卵母细胞处于初级卵母细胞大生长期的晚期，3—5 月，卵黄颗粒迅速积累，充满了除液泡层外的细胞质，细胞核也发生偏位，辐射带增厚，平均厚度为3.6 μm。滤泡膜由两层滤泡细胞构成。第4 时相卵母细胞早期直径471～1093 μm；而晚期直径为1374～1764 μm（图版Ⅲ-7、8）。

Ⅴ期卵巢呈黄色，卵粒游离在卵腔中，轻压腹部就会流出体外。此期卵粒饱满，略带光泽。Ⅴ期卵巢以第5 时相卵母细胞为主，其卵黄颗粒融合成板块状，且卵母细胞与滤泡膜处于分离状态。第5 时相卵母细胞的直径为（1730.52±89.68）μm（图版Ⅲ-9）。

Ⅵ期卵巢呈半透明的深红色，由于成熟卵的排出，卵巢显著萎缩、大量充血。卵巢中有少量第2、第3 时相的卵母细胞和大量空滤泡，还有极少量正处于退化阶段的未产出的卵粒，性成熟个体产卵后的卵巢属于Ⅵ期卵巢（图版Ⅲ-10）。

3 讨论

3.1 池塘养殖下湘华鲮的性腺特征

据文献记载，野生湘华鲮群体中雌、雄个体最小性成熟年龄为2 龄，群体完全性成熟需要到3 龄[1,2]。繁殖季节，性成熟的雌性个体性腺指数为（15.72±2.26）%，怀卵量8～10 万，卵径（2.11±0.13）mm[1,2]。本研究中，池塘养殖人工繁育的湘华鲮子一代性腺发育良好，能进行催产繁殖。但与野生群体相比，池塘养殖湘华鲮的性腺发育状况存在以下不同：（1）性腺发育较野生群体迟缓，群体完全性成熟年龄推迟了2 年；（2）养殖群体中性成熟雌鱼的性腺指数最高为10.97%，怀卵量2～3 万，卵径（1.73±0.89）mm，表明湘华鲮子一代培育的性腺发育还需要进一步研究与探索。性体指数、怀卵量及卵径是衡量鱼类性腺发育和性腺质量的重要数量指标[11]。亲鱼的性腺发育和卵黄形成是亲鱼培育的关键，此过程受水环境、营养饲料及日常管理等多重因素的影响[12-15]。野生湘华鲮在河滩觅食，分批洄游至有急流的场地产卵，运用池塘循环水槽养殖模式开展仿生态的流水养殖，能否促进养殖湘华鲮的性腺发育，还需要进一步的研究。

3.2 养殖湘华鲮精巢结构及发育特点

鱼类精巢从分化到成熟，主要经历结构和精子发生等变化，一般分为六个时期[16]。鱼类的精巢按照生殖细胞的排列方式及分布特点，一般为小叶型精巢和管型精巢两种类型[7,17-19]。大部分鲤科鱼类精巢为小叶型[10,12,20]，本研究组织观察发现，湘华鲮精巢属于小叶型精巢。4 龄及以上的性成熟雄湘华鲮，3 月时精巢处Ⅲ～Ⅳ期，在4 月下旬—5 月初精巢可自然发育至第Ⅳ～Ⅴ期，这说明养殖湘华鲮的精巢发育良好，已经具备催产条件。

3.3 养殖湘华鲮卵巢发育及产卵类型

卵母细胞经过两个生长期发育成熟，第2 时相的卵母细胞的胞质增多为第一个小生长期，第3、4时相卵母细胞的生长为第二个大生长期，此期卵黄颗粒大量积累、辐射膜增厚、细胞核移位[7]。大部分5 龄左右的养殖湘华鲮卵巢才发育至Ⅳ期。养殖湘华鲮雌鱼性成熟年龄为5+，大于雄鱼的性成熟年龄4+。这可能与雌湘华鲮在性成熟过程中需要更多的营养物质积累有关，尤其是卵黄形成期，除了积累卵黄，还需要合成和积累各类RNA、糖原颗粒、核糖体、脂质及线粒体等物质[21,22]。

根据硬骨鱼类卵巢的组织学特征和产卵习性，产卵类型可划分为一次性产卵和多次性产卵[8,17,23,24]。随着湘华鲮卵巢发育进入Ⅳ期末，第4 时相卵母细胞占切片面积的96%以上，卵径大小比较整齐，第3时相卵母细胞已很少，说明湘华鲮卵巢内的卵母细胞是同步成熟。产后的卵巢中基本无第4 时相卵母细胞，第3 时相的卵母细胞处于退化阶段，只剩下第2 时相的卵母细胞和大量空滤泡（图版Ⅲ-10），说明养殖湘华鲮和野生湘华鲮都是一年产卵一次。养殖湘华鲮卵巢发育放缓且一年产卵一次，建议在五月初选择6 龄以上雌性、5 龄以上雄性的亲本进行催产，提高繁殖效率，也有利于亲鱼保护。

图版Ⅰ 湘华鲮性腺解剖图Plate Ⅰ Gonads in Sinilabeo decorus tungting

图版Ⅱ 湘华鲮的精巢发育Plate Ⅱ Characteristics of testis development at different stages in Sinilabeo decorus tungting