根瘤菌与固氮菌联合对毛叶苕子的促生效果

魏志敏，孙斌，方成，代子雯，刘满强，焦加国，胡锋，李辉信，徐莉

（南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095）

毛叶苕子（Vicia villosa）为豆科巢菜属，其生长快，生物量大，粗蛋白含量高，是优良的饲料作物［1］。同时其固氮能力强，也是一种优质的绿肥作物［2−4］。目前，作为稻区常用的一种冬季绿肥，不仅能充分利用稻田冬闲时期的水、光、热和土地资源，翻压还田为后茬水稻（Oryza sativa）提供养分，起到化肥减施的效果，同时还能改善土壤理化性状［5−7］，提高作物产量［8−10］，改善生态环境［11］。

豆科植物−根瘤菌共生体系是自然界存在的最主要的生物固氮体系之一，全球每年生物固氮达1.75 亿吨，土壤中70%氮素来自生物固氮［12］，其中生物固氮的65%来自豆科植物与根瘤菌共生体系［13］。此外，也有自生氮菌参与固氮，自生固氮菌除固定少量氮外，有些还能分泌吲哚乙酸类似物和赤霉素类物质［14］，能活化土壤中的磷、钾［15−16］，不仅刺激农作物的根系发育，还能促进土壤有机物质的矿化。

利用生物接种的方法可以固定土壤中的氮素，能起到提高牧草产量和质量、减少化肥投入、提升土壤肥力、倒茬轮换、保护环境等作用，对于保障国家粮食安全、资源环境可持续利用、促进优质农产品生产和农民增收方面具有重大意义。研究表明根瘤菌可以促进毛叶苕子、箭筈豌豆（Vicia sativa）以及苜蓿（Medicago）等豆科绿肥的生长［17−19］，还可以明显促进农业作物大豆（Glycine max）的生长［20］。施用根瘤菌菌剂能有效提高豆科植物的产量，还可以改良土壤的肥力，对农业生产具有积极的意义，已成为豆科植物增产的主要措施［21］。而传统的根瘤菌菌剂往往存在环境适应性差、占瘤率低和接种效果不稳定等问题，制约了其应用和发展。近年来，根瘤菌剂已由单一菌种、单一功能向复合菌种、多功能方向发展。李晓旭等［22］研究表明大豆根瘤菌、解磷菌、解钾菌的复合菌剂可增加土壤养分的有效性、提高作物抗性也可增加大豆的株高、干重和百粒重，进而提高作物产量。而目前关于豆科绿肥作物专用复合根瘤菌菌剂的报道较少。在固氮功能上，虽然普遍认为自生固氮菌固氮量很低，但它不需要与一定的植物配合，具有条件宽、适应性广的特点，在天然生态系统的氮素循环中也具有重要作用。此外，很多植物促生菌包括自生固氮菌能够在共接种中促进根瘤菌的结瘤，起到促进固氮的作用［23］。因此，本研究通过前期固氮功能菌的筛选，获得高效自生固氮菌菌株N3，联合南京农业大学生命科学学院根瘤固氮实验室提供的能在毛叶苕子上成功结瘤并固氮的豌豆（Pisum sativum）根瘤菌菌株Vic5 进行复配，在温室盆栽条件下，研究单一和复合接种对绿肥作物−毛叶苕子的促生效果以及土壤性质的影响，为研发豆科绿肥专用菌剂提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）菌株N3 分离自种植花生（Arachis hypogaea）根际土壤，菌株固氮酶活性达 C2H428.33 nmol·h−1·mL−1；豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）菌株 Vic5 由生物科学院根瘤固氮实验室提供，菌株根瘤固氮酶活性达 15492.16 μmol·min−1·g−1·plant−1。供试作物：豆科巢菜属毛叶苕子。供试土壤（未灭菌）：采自山东泰安综合试验站（117°0′27″E，35°59′55″N），采样深度为0～20 cm，土壤类型为棕壤褐土。供试土壤基本理化性质为：pH 值 7.19，有机质 25.77 g·kg−1，全氮 1.40 g·kg−1，NH4+-N 1.84 mg·kg−1，NO3−-N 5.84 mg·kg−1，全磷 0.74 g·kg−1，速效磷 17.24 mg·kg−1，速效钾 149.18 mg·kg−1。培养基配方：LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，pH 7.0～7.2。TY 培养基：胰蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，氯化钙0.67 g，pH 7.0～7.2。培养基配置时均用蒸馏水定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.2 毛叶苕子盆栽试验

试验设计：盆栽试验于2019 年3−5 月在南京农业大学土壤生态实验温室二楼中进行。共设4 个处理：1）不接菌处理CK；2）单一接种巨大芽孢杆菌菌株N3；3）单一接种豌豆根瘤菌菌株Vic5；4）复合接种菌株N3+Vic5。每个处理 4 次重复。步骤：1）将 N3 接种于 LB 液体培养基，28 ℃、180 r·min−1振荡培养 24 h，Vic5 接种于 TY 液体培养基，28 ℃、180 r·min−1振荡培养 2～3 d，无菌条件下把菌液倒入已灭菌的离心管中，8000 r·min−1离心 5 min，去掉上清液，再用无菌水重悬菌体，制成菌悬液待用。2）试验前将毛叶苕子种子进行消毒处理：首先用3%双氧水表面消毒20 min，再用无菌水反复冲洗。将消毒过的种子浸泡在盛有浓硫酸的烧杯中10 min，用无菌水反复冲洗后平铺于灭菌的大平皿上，置于28 ℃环境中催芽，每12 h 用无菌水冲一次，去掉种子表面的分泌物。3）将催芽的种子用3%双氧水消毒2.5 min，无菌水清洗7～8 次，小心剥去种子表皮待用。将供试土壤过5 mm 筛以混合均匀并除去土壤中的根系残体及凋落物，装填3 kg 过筛的土壤于10 cm×20 cm 的花盆中，加水至最大田间持水量的80%左右。平衡1 d 后，每盆穴播催芽后的毛叶苕子10 颗，同时接种菌液于穴中，接种量按108CFU·g−1土接入，复合处理中两株菌比例为1∶1，让菌液与种子充分接触，生长期采用称重法将盆栽土壤水分含量控制在土壤最大持水量的80%左右。种植3 个月后，每盆采集长势一致的毛叶苕子3 株，同时采集土壤样品。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 毛叶苕子根系形态的测定 采用根系扫描仪（LA1600+scanner，加拿大）扫描毛叶苕子根系形态，获取根系图（WinRHIZO 2003b，加拿大）进行相关根系指标分析。

1.3.2 毛叶苕子根瘤固氮酶活性的测定 采用乙炔还原法［24］：将毛叶苕子的瘤体全部剪下置于20 mL 顶空瓶中，用密封的1 mL 注射器抽出顶空瓶中1 mL 气体，立即注入1 mL 高纯度的乙炔气体，使用封口膜密封针孔。将瓶子倒置于28 ℃培养箱中培养2 h 后，用1 mL 密封的注射器抽出1 mL 反应气体注入2 mL 顶空瓶中，同时从顶空瓶中抽出1 mL 空气，检测时用上样器抽取100 μL 于2 mL 顶空瓶中的制备气体注入气相色谱仪上（Agilent，美国）样口中，进行乙烯乙炔峰高值检测。样品检测后将所有瘤体于烘箱中50 ℃烘干后称取干重。

1.3.3 土壤肥力指标的测定 土壤pH 采用无CO2水浸提，pH 计测定；采用外加热重铬酸钾容量法测定土壤有机质；采用凯氏定氮法测定土壤全氮；土壤全磷采用HClO4−H2SO4消煮，钼锑抗比色法测定；土壤铵态氮、硝态氮均采用2 mol·L−1KCl 浸提，连续流动分析仪（Seal-AutoAnalyzer3，德国）测定；土壤速效磷采用 0.5 mol·L−1NaHCO3浸提，钼锑抗比色法测定；土壤速效钾采用CH3COONH4浸提，火焰光度法测定［25］。

1.3.4 土壤生物学性质测定 土壤基础呼吸（soil basal respiration，SBR）的测定［25］：称取10.0 g 新鲜土壤到100 mL 盐水瓶中，黑暗室温条件培育24 h 后通风2 h。密封后黑暗条件下培养4 h。用10 mL 注射器吸取10 mL气体，采用气相色谱（Agilent，美国）测定CO2浓度。土壤微生物量碳（microbial biomass carbon，MBC）和微生物量氮（microbial biomass nitrogen，MBN）的测定［26］：采用氯仿熏蒸−硫酸钾浸提法，用K2CrO7外加热法测定滤液中MBC 含量；采用半微量凯氏定氮法测定MBN 含量。土壤固氮酶活性采用乙炔还原法［24］：取盆栽土样15 g 于100 mL 血清瓶中，加入0.1 mol·L−1葡萄糖液2 mL，塞上异丁基胶塞摇匀，加铝盖密封。用注射器从瓶中抽出5 mL 空气再注入等体积乙炔气体，密封针眼，28 ℃培养2 d。培养结束后，取500 μL 气样在气相色谱仪上测定乙烯峰值。乙炔还原活性（acetylene reduction activity，ARA）计算公式为：

式中：K为乙烯峰高/乙炔峰高，T为绝对温度，X为测定时的气温，Y为测定时的大气压，760 为标准大气压（汞柱），Z为注入乙炔的量（mL），22.4 为每1 摩尔气体在绝对温度和标准大气压下的体积（L），W为测定样品的干重（g），t为注入乙炔后的反应时间（h）。

1.4 数据统计与分析

用Microsoft Excel 2007 软件处理数据，运用SPSS 20.0 进行单因素方差分析，用LSD 和Duncan’s 检验法多重比较进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同处理对毛叶苕子生长的影响

2.1.1 不同处理下毛叶苕子的生长情况 与CK 相比，单一接种菌株N3 对毛叶苕子生物量和结瘤数有增加的趋势，且能显著提高其根瘤固氮酶活性（表1）。单一接种菌株Vic5，毛叶苕子地上和地下部鲜重、结瘤数和根瘤固氮酶活性都显著增加，单一接种菌株Vic5 的促生效果好于单一接种菌株N3。复合接种菌株N3 和Vic5 处理下，毛叶苕子生物量最大、结瘤数最多、根瘤固氮酶活性最高，说明复合接种对毛叶苕子的促生效果好于单一接种。

表1 不同处理对毛叶苕子植株的影响Table 1 Effects of different treatments on V.villosa

2.1.2 不同处理下毛叶苕子的根系发育情况 相比CK，单一接种菌株N3 可显著提高毛叶苕子根长和根尖数，单一接种菌株Vic5，毛叶苕子的根系总长、表面积、体积以及根尖数都有显著提高。复合接种菌株N3 和Vic5处理下，毛叶苕子根系总长、表面积、体积、根尖数达到最高，分别是对照的2.05、2.04、3.00、2.40 倍（表2）。

表2 不同处理对毛叶苕子根系的影响Table 2 Effects of different treatments on the root of V.villosa

2.2 不同处理对土壤性质的影响

2.2.1 不同处理对土壤基础理化性质的影响 所有接菌处理对土壤pH 无显著影响（表3）。相比CK，单一接种菌株N3 处理，土壤全磷、速效磷和速效钾含量显著提高；单一接种菌株Vic5 处理，土壤NH4+-N 和NO3−-N 含量显著提高；二者复合接种处理下，土壤有机质含量、全氮、全磷、速效钾、NH4+-N 和NO3−-N 含量均显著增加，分别是对照的 1.10、1.06、1.12、1.07、1.92 和 1.60 倍。

表3 不同处理对土壤性质的影响Table 3 Effects of different treatments on soil properties

2.2.2 不同处理对土壤基础呼吸的影响 土壤呼吸作用是反映土壤碳氮循环与生物活性的重要指标。相比CK，单一接种菌株Vic5 和菌株N3+Vic5 复合处理均显著提高了土壤基础呼吸强度，增幅为57.14%～100.00%，单一接种菌株N3 处理下，土壤基础呼吸强度略有升高，但并不显著（图1）。

图1 不同处理对土壤基础呼吸的影响Fig.1 Effects of different treatments on soil basal respiration

2.2.3 不同处理对土壤微生物量碳、氮的影响 相比CK 处理，单一接种菌株N3 处理，土壤微生物量碳、氮含量略微升高，但差异并不显著；单一接种菌株Vic5 能有效提高土壤微生物量碳、氮含量；菌株N3+Vic5 复合处理下，土壤 MBC 和 MBN 含量最高，达168 μg·g−1和 62.58 μg·g−1，复合接种处理比单一接种处理表现出更好的提升效果（图2）。

图2 不同处理对土壤微生物量碳、氮的影响Fig.2 Effects of different treatments on soil microbial biomass carbon and soil microbial biomass nitrogen

2.2.4 不同处理对土壤固氮酶活性的影响 与CK 相比，所有接菌处理均能显著提高土壤固氮酶活性（图3）。单一接种菌株N3 的提升效果低于单一接种菌株Vic5 的处理；复合菌株接种处理提升效果最好，土壤固氮酶活性达 C2H453.77 nmol·g−1·h−1，是对照的 1.95 倍。

图3 不同处理对土壤固氮酶活性的影响Fig.3 Effects of different treatments on soil nitrogenase activity

3 讨论

相比不接菌处理，单一接种豌豆根瘤菌菌株Vic5 和自生固氮菌菌株N3 均能促进毛叶苕子的生长，毛叶苕子在无外源氮素添加条件下，通过固氮微生物的生物固氮作用可以提供其生长需要的氮素。单一接种自生固氮菌N3 不影响毛叶苕子的结瘤数，但是会促进根瘤固氮酶活性。单一接种豌豆根瘤菌Vic5 不仅能促进毛叶苕子结瘤，也能提高根瘤固氮酶活性，这与付萍［18］研究发现接种有效根瘤菌可增加箭筈豌豆根瘤数量及根瘤固氮酶活性的结论一致。复合接菌处理下的毛叶苕子生物学性状优于单一接种处理，相比单一接种N3 和Vic5 处理，毛叶苕子地上部生物量分别增加了90.20%和10.23%，结瘤数和根瘤固氮酶活性分别显著增加了187.80%和103.37%、35.63%和38.14%，这和刘丽等［27］的研究结果慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌双接种可以促进大豆生长，显著增加大豆的占瘤率和大豆产量一致。双接种协同效益发生的可能原因是有一些菌株能分泌激素类物质如吲哚乙酸（3-Indoleacetic acid，IAA），或者解磷功能，改善植物生长和养分供应，调控植物根瘤的产生和固氮酶活性；一些植物促生菌会产生细胞壁溶解酶，促进根瘤菌的侵染，促进结瘤［28］；此外根瘤菌接种，还可以激活土壤中已经存在的一些无效低活性的土著根瘤菌，进而促进结瘤固氮［29］。本研究所用固氮菌N3 也分泌IAA，并有解磷能力，通过改善毛叶苕子的生长情况，调控根瘤的形成和发育，至于其他机制还需进一步的试验证实。另外有研究表明较高氮素水平下，接种根瘤菌更有利于根瘤的着生［30−31］，本研究通过自身固氮菌N3 的辅助接种也有利于土壤氮水平的提高，从而进一步促进结瘤固氮达到根瘤菌与促生菌混合接种协同的优势［32］。

根系形态特征与植物利用土壤养分的效率密切相关，养分亏缺条件下，根系形态构型参数有敏感的适应性变化，研究证明植物适应低氮胁迫的重要机制之一是对根系发育的促进作用，这反过来也会帮助植物对营养元素的吸收［33］。N3 处理对毛叶苕子根系生长有一定的促进作用，与之前研究该巨大芽孢杆菌有一定的产IAA 和溶磷能力，且对二月兰（Orychophragmus violaceus）根系生长发育有良好的促进作用的结果一致［34］。复合接菌对毛叶苕子根系生长发育可以起到更好的促进作用，根系总长、根表面积、根体积以及根尖数等均有显著增加。这与马文彬等［35］研究接种根瘤菌、固氮菌和溶磷菌均能促进箭筈豌豆根系生长，且根瘤菌+固氮菌+溶磷菌复合接种对其的促进作用优于单一接种是一致的结果。

人工接种微生物是维持和提高土壤肥力的有效手段，所有接菌处理对土壤pH 影响不大，N3 处理下土壤速效磷和速效钾含量最高，这与菌株N3 对土壤磷、钾的活化作用有关［34］。根瘤菌可以增加土壤中氮素来源，同时根瘤菌脱落、残留及分泌到土壤中的氮，可增加土壤肥力从而改良土壤，因此Vic5 处理土壤铵态氮和硝态氮含量较N3 处理高。复合接菌能有效提高土壤有机质、氮、全磷、速效磷和速效钾含量，研究表明多种菌复合菌剂能增加土壤氮、磷、钾的利用率，还能加速有机质的分解，拮抗病原微生物，刺激作物生长［36］。复合接菌处理下土壤基础呼吸作用最强，微生物量碳、氮含量最高，这与复合处理下土壤有机质和全氮含量的增加，可为土壤中微生物的生长提供充足的碳源和氮源，以及根瘤菌接种能提高植物根际微生物数量有关［37］。土壤固氮酶活性在一定程度上能够反映土壤固氮微生物固氮酶作用能力强弱，土壤氮素含量与固氮微生物的活动密切相关，共生体系由于固氮微生物直接从寄主植物获得碳水化合物作为固氮能源，其固氮能力比自生固氮微生物强得多［38］，因此Vic5 处理土壤固氮酶活性高于N3 处理。

总之，本研究表明复合接种豌豆根瘤菌Vic5 和固氮菌N3 能够有效促进毛叶苕子生长，并改善土壤性质，同时发现单一接种两株不同菌株对毛叶苕子生长和土壤性质的影响不同，筛选构建合适匹配的微生物菌剂对于绿肥作物的高效种植具有重要意义。在“绿水青山就是金山银山”的发展理念主导下，绿肥科研工作中如何提升轻简化高效生产能力，研发高效根瘤菌剂等专用产品非常重要［39］。当然也有研究表明在田间条件下双接种根瘤菌剂及解磷菌剂相较于单接种根瘤菌剂并没有促进大豆结瘤，提高大豆产量［40］。虽然根瘤菌与促生菌混合接种具有一定的优势，但由于田间环境的复杂性，土著微生物对根瘤菌剂的竞争等［41］，都会造成效果的减弱。因此后续优化固氮菌的发酵培养基来获得更高的活菌数，筛选合适的菌剂载体，提高固氮菌剂配合根瘤菌剂的应用效果，确定固氮菌的最优应用方式及与根瘤菌剂用量等方式来发挥双接种的固氮菌剂与根瘤菌剂相应的作用需要进一步深化研究。

4 结论

接种豌豆根瘤菌Vic5、固氮菌N3 均能促进毛叶苕子生物量的增加和根系发育。单一接种Vic5 对毛叶苕子的促生效果优于单一接种N3 处理，复合接菌处理对毛叶苕子的促生效果最好。复合接菌还能有效提高土壤有机质、土壤微生物量碳、氮含量及土壤固氮酶活性，同时能显著提高毛叶苕子的结瘤固氮能力。