N-乙酰半胱氨酸对HT22细胞辐射诱导氧化应激及增殖和凋亡的影响

黄 越，陈乃耀，赵 辉，闫振宇，张海霞，赵雪聪，张丁平

(1.华北理工大学附属医学院血液内科，河北 唐山 063000；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院重点实验室，天津 300134)

随着颅脑肿瘤的发病率逐渐升高，颅脑放射治疗已成为颅内原发和继发肿瘤的主要治疗手段[1]。但辐射会损伤周围健康的脑组织，产生辐射相关的认知功能障碍[2]。目前对于导致辐射相关的认知功能障碍的病理生理学仍缺乏深入的了解，也缺乏行之有效的预防和治疗措施。研究发现，辐射相关认知功能障碍与海马区神经元的丢失、减少新生神经元的产生关系密切[3]。其中辐射导致的活性氧的过量积聚和神经炎症是神经元丢失的重要原因[4]。电离辐射可直接与关键的有机生物分子相互作用产生自由基；也可间接通过分解细胞内的水产生活性氧(ROS，电离的间接效应)，如H2O2、O2-·和·OH[5]。这些过度生成的ROS不仅会破坏DNA的含氮碱基、嘌呤、嘧啶和脱氧核糖骨架，还会损伤线粒体DNA、蛋白质/酶和膜，使线粒体中ATP生成障碍，诱发细胞凋亡[6]。了解颅脑照射对神经元细胞的影响及分子机制，可能为改善临床暴露于电离辐射后认知障碍的防治策略提供重要线索。HT22细胞是一种永生化的小鼠海马脊髓细胞系，与未分化的神经干细胞相似并表达神经元特异性烯醇化酶和神经丝蛋白，已被广泛用作中枢神经系统退行性疾病的体外模型[7]。本实验应用直线加速器放射治疗机照射HT22细胞，应用N-乙酰半胱氨酸干预，观察细胞内活性氧及其代谢产物的变化，以及对HT22细胞增殖和凋亡的影响，以期探讨放射性脑损伤的发生机制，并为放射性脑损伤防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小鼠海马神经元细胞系HT22细胞购自上海赛百康生物技术有限公司；直线加速器放射治疗机(美国VARIAN公司)由华北理工大学附属医院放疗科提供；胎牛血清购自PAN；0.25%EDTA-胰酶购自美国Gibico公司；抗青霉素/链霉素溶液、DMEM高糖培养基均购自CORNING公司；抗氧化剂NAC购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；FITC Annexin V Apoptisis Detection Kit购自美国BD公司；GSH、SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；冰醋酸购自天津化学试剂公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自ZOMANBIO；BCA法蛋白定量试剂盒购自MultiSciences公司；BSA购自BOVOGEN； DCFH-DA购自Caymar；抗β-actin抗体购自 Abcam公司；抗cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2抗体购自北京博奥森公司；鼠二抗体购自KPL公司。

1.2 实验方法

1.2.1HT22细胞培养

将HT22细胞培养在T25培养瓶中，加入含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM高糖培养基，37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养，待细胞长至80%～90%融合时，1∶4传代。

1.2.2细胞用药配制

CCK-8确定NAC的最佳给药剂量为5 mmol/L。称取1.35 g NAC，溶于超纯水配成1 mol/L的储存液，并通过0.22 μm膜过滤除去细菌，使用前用DMEM高糖完全培养基配成5 mmol/L的工作液，用于后续实验。

1.2.3细胞辐射模型的建立及辐射剂量范围的确定

1.2.4实验分组

实验分组为：①空白对照组(Control)：加入完全培养基，不给予照射；②单纯辐射组(RT)：加入完全培养基，给予10 Gy X射线照射；③辐射+NAC组(RT+NAC)：用NAC预先处理HT22细胞1.5 h后加入完全培养基，再给予10 Gy X射线照射。

1.2.5HT22细胞形态变化观察

细胞接种T12.5培养瓶后，当细胞密度达70%时，按分组给予不同刺激，24 h后用倒置显微镜观察并随机拍摄5个视野，记录细胞数量及生长形态变化。

1.2.6CCK-8法检测HT22细胞增殖

细胞接种于96孔板后，培养24小时后按分组给予不同刺激，CCK-8法检测HT22细胞的增殖率，每组设置3个复孔。

1.2.7Annexin/PI双标记法检测HT22细胞凋亡

布置于弯管侧壁面的贴片(方1～14)损伤形貌特征主要表现为：除了串坑外，砂粒冲击的坑明显直径较小，分布密集,这是因为弯管段冲蚀和腐蚀并存并交互影响，但又有不同的优势区。当流动携带的砂粒与贴片接触时间较长且法向冲击速度较小时，管道壁面上容易产生划痕；当接触时间较短且冲击应力较大时，材料表面上主要产生压痕。材料大部分的质量损失都是条状划痕和三角状压痕引起的，压痕和划痕是砂粒冲蚀的主要破坏形式。结合弯管流场分析可知，弯管外拱壁处流动在较高压强和离心力作用下，固相颗粒具有较大的动量，颗粒频繁、多次冲击壁面，致使金属表层材料的剥落十分严重。

细胞分组及处理后继续培养24 h，用无EDTA胰酶消化，收集细胞和上清液，用PBS清洗2次；1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，加入适量1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞密度大约为1×106个/mL。加入5 μL Annexin V-FITC避光染色15 min，再加入5 μL PI，室温、避光孵育5 min；1 h内流式细胞仪检测荧光强度。

1.2.8细胞内ROS检测

细胞分组及处理后继续培养24 h，加入DCFH-DA染液，37 ℃温箱中孵育30 min，荧光显微镜(TE-2000 Nikon，日本)下随机拍照记录5个高倍镜视野，应用图像分析软件(Image J 1.47i)软件计算出绿色荧光强度的平均值，荧光强度可间接反映细胞内氧化应激的情况，实验重复3次。

1.2.9细胞内GSH、SOD，MDA水平

细胞分组及处理后继续培养24 h，收集细胞，用预冷PBS洗涤2次，超声破碎细胞，Bradford法测定蛋白浓度，严格按试剂盒说明书步骤操作，分光光度计检测细胞内GSH、MDA水平及SOD活性。

1.2.10Western blot法检测HT22细胞中促凋亡及抗凋亡蛋白

细胞分组及处理后继续培养24 h，用预冷PBS洗涤2次，加入蛋白质裂解液裂解，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，回收上清(蛋白质)，取少量上清液用BCA试剂盒测定蛋白浓度，剩余上清液进行蛋白测定。等量上样，进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上、5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗膜3次，每次10分钟，然后一抗4 ℃孵育过夜(抗β-actin 1∶50 000稀释，抗Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 1∶1 000稀释)，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，利用增强化学发光技术显影，用ImageJ软件进行灰度值分析。每组实验重复3次。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析：测量资料以均数±标准差表示，所得数据进行单因素方差分析，p<0.05表示差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 照射剂量对HT22细胞存活率的影响

如图1所示，给予HT22细胞不同照射剂量后，CCK-8结果显示，2 Gy照射剂量对细胞增殖无明显影响，当照射剂量大于2 Gy时，随着照射剂量的增加，HT-22细胞增殖率呈剂量依赖性降低(p<0.01)，当照射剂量为10 Gy时，细胞增殖率接近50%。

注：**与0 Gy辐射剂量组比较, p<0.01(n=3)。图1 不同剂量X射线照射对HT-22细胞增殖活力的影响Fig.1 Effect of different doses of X rayon the viability of HT-22 cells

2.2 RT和NAC对HT22细胞增殖率的影响

如图2所示，给予10 Gy X射线照射，分组处理后继续培养24 h，CCK-8法检测HT22细胞的增殖率。与Control组相比，RT组HT22细胞增殖率明显受到抑制(p<0.01)；与RT组相比，RT+NAC组HT22细胞增殖率明显增高(p<0.01)。

注：**与Control组相比，p<0.01；##与RT组相比，p<0.01。图2 RT和NAC对HT22细胞增殖率的影响Fig.2 Effects of RT and NAC on theproliferation rate of HT22 cells

2.3 RT和NAC对HT22细胞凋亡的影响

给予10 Gy X射线照射，分组处理后继续培养24 h，应用Annexin/PI双标记法检测HT22细胞凋亡率，结果示于图3。由图3可见，与Control组相比，RT组细胞凋亡率显著增加(p<0.01)，与RT组相比，RT+NAC组细胞凋亡率显著减少(p<0.01)。

2.4 RT和NAC对HT22细胞内ROS水平的影响

细胞分组及处理后继续培养24 h，加入DCFH-DA染液，荧光显微镜检测 DCF 的荧光强度，结果示于图4。由图4可见，与Control组相比，RT组荧光强度显著增强(p<0.01)，提示细胞内活性氧的水平显著增高；与RT组相比，RT+NAC组荧光强度显著减弱(p<0.01)，提示细胞内活性氧的水平降低。

2.5 RT和NAC对HT22细胞内GSH、MDA水平及SOD活性的影响

细胞分组及处理后继续培养24 h，分光光度计检测细胞内GSH、SOD、MDA水平，结果示于图5。由图5可见，与Control组相比，RT组细胞内MDA显著增加(p<0.01)，GSH水平及SOD活性显著降低(p<0.01)。与RT组相比，RT+NAC组细胞内MDA显著减少(p<0.01)，GSH水平及SOD活性显著增强(p<0.01)。

注：**与Control组相比，p<0.01；##与RT组相比，p<0.01。图3 RT和NAC对HT22细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of RT and NAC on apoptosis of HT22 cells

图4(A) RT和NAC对HT22细胞内ROS的荧光强度的影响(200×)Fig.4(A) Effects of RT and NAC on thefluorescence intensity of ROS in HT22 cells

注：**与Control组相比，p<0.01；##与RT组相比，p<0.01。图4(B) ROS荧光强度定量分析Fig.4(B) Quantitative analysis of ROSfluorescence intensity

2.6 RT和NAC对HT22细胞内促凋亡及抗凋亡蛋白的影响

结果示于图6。由图6可见，Western blot结果显示与Control组相比，RT组细胞内凋亡蛋白Cleaved-caspase-3及Bax/Bcl-2显著增加(p<0.01)。与RT组相比，RT+NAC组细胞内Cleaved-caspase-3及Bax/Bcl-2显著减少(p<0.01)，但仍比对照组高近一倍。

3 讨论

注：**与Control组相比，p<0.01；##与RT组相比，p<0.01。图5 RT和NAC对HT22细胞内GSH、MDA、SOD水平的影响Fig.5 Effects of RT and NAC on the levels of GSH, MDA and SOD in HT22 cells

注：**与Control组相比，p<0.01；##与RT组相比，p<0.01。图6 RT和NAC对HT22细胞内蛋白含量的影响Fig.6 Effect of RT and NAC on protein content in HT22 cells

众所周知，海马区在学习和记忆中扮演着重要角色。全脑放疗过程中海马神经干细胞损伤是记忆衰退的核心，海马适形回避与记忆保存有关[8]。在成年哺乳动物大脑中，海马齿状回的颗粒下区(subgranular zone, SGZ)的神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)可以在不同的刺激下分化产生新的神经元[9]。神经祖细胞/干细胞经历增殖、分化、迁移和成熟的过程通常被认为是神经发生的过程。这一过程对氧化应激极为敏感，氧化应激和神经原性微环境中氧化还原平衡的持续改变被认为是辐射介导的海马神经发生变化的重要原因[3]。尽管导致辐射诱导的脑损伤细胞和分子机制尚不清楚，但一般认为，放疗所致的神经元发生减少、丢失过多以及存活神经元细胞的结构和功能的变化是导致认知功能障碍主要原因。电离辐射可引发增殖神经元细胞(主要是激活神经干细胞和神经祖细胞)的凋亡，导致新生神经元发生减少[10-11]；也可导致神经干细胞微环境的炎症和血管损伤抑制神经元细胞的增殖与再生[12]。研究发现，电离辐射以剂量依赖性的方式诱导海马区和室下区神经前体细胞的丢失，与细胞中ROS的产生密切相关[13]。即使是低剂量的辐射也会导致氧化应激的持续升高和海马神经发生持续抑制。许多硫醇抗氧化剂曾被用作放射防护剂，但由于其毒性而受到限制。NAC作为一种具有抗氧化特性、耐受性好、安全的非处方药物，已在世界各地广泛使用。研究表明，NAC可能参与调节多种精神和神经疾病的病理生理过程，包括氧化应激、神经发生和细胞凋亡、线粒体功能障碍、神经炎症等[14]。我们用HT22细胞建立辐射损伤的细胞模型，应用NAC进行干预，观察辐射后细胞内氧化应激变化情况，以及对HT22细胞增殖和凋亡的影响，旨在探讨放射性神经元损伤的发生机制，为放射性脑损伤的防治提供新的思路。

越来越多的证据表明，ROS、GSH、SOD、MDA与氧化应激密切相关[15]。与其他器官相比，大脑具有更高水平的不饱和脂肪酸并需要消耗更多氧气进行代谢[16]。受到损伤后大脑内氧气消耗增加可能会促进超氧阴离子的产生，并引发一系列级联反应，形成H2O2和OH-，从而导致ROS形成[17]。NAC作为半胱氨酸的前体，进入细胞后直接与ROS发生亲核反应，以清除ROS。在体外实验中发现，NAC可直接清除H2O2、羟基自由基和次氯酸[18]。增加的ROS攻击细胞分子如膜脂、蛋白质和核DNA，与多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，形成脂质过氧化物MDA，导致膜不稳定和脂质过氧化。因此细胞内MDA的含量变化常常能反映机体脂质过氧化的程度，间接反映细胞受损的程度[19]。NAC可以保护细胞膜免受脂质过氧化和蛋白质氧化，并有助于维持细胞器的完整性[20-21]。因此，NAC可减少细胞内ROS和MDA的积聚，这与本实验结果一致。

NAC也可通过酶促防御系统(SOD)或非酶系统(GSH)抵抗氧化应激的损伤[22-23]。NAC既是GSH的类似物又是细胞内合成GSH的前体，具有恢复细胞氧化还原稳态的特性，在保护细胞免受辐射诱导的氧化应激中发挥重要作用[18]。体外和体内研究均表明，NAC不仅能够通过将细胞外胱氨酸还原为半胱氨酸来补充细胞内GSH[24]，还可以通过补充巯基(—SH)基团刺激GSH合成并提高谷胱甘肽-S-转移酶的活性[25]。NAC进入细胞后促进GSH的产生，GSH可直接清除ROS，减少H202的生成[26]。β-谷氨酸-半胱氨酸连接酶是细胞内GSH生物合成中产生谷氨酰半胱氨酸的限速酶，Ozaras等证明，NAC通过提高细胞内β-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性、升高GSH保护肝脏免受氧化应激损伤[27]。因此，在本研究中辐射暴露后由于GSH参与了ROS的消除，所以GSH快速消耗。而NAC治疗可逆转氧化应激过程中GSH的耗竭和自由基的形成[28]。此外，SOD也是一种重要的抗氧化酶，电离辐射和许多氧化还原化学物可在短时间内使细胞内产生大量的O2·-，O2·-的过量产生可导致广泛的扩散损伤[29]。SOD可将O2·-分解为H20和氧分子，是抵抗细胞和组织中O2·-的第一道防线，也被认为是防止由ROS和脂质过氧化引起损伤的主要防线[30]。NAC处理可提高细胞内SOD的活性，从而增强细胞的抗氧化能力[23]。与本实验结果相符。

细胞凋亡是一种“程序性细胞死亡”，Bcl-2 家族是调控凋亡的重要基因家族，主要参与线粒体途径介导的凋亡[31]。其中促凋亡蛋白 Bax与抗凋亡蛋白 Bcl-2 的比例是决定细胞是否发生凋亡的重要因素[32]。当Bax/Bcl-2比例增高时，促进细胞色素C(cytochrome C, Cyt-C)的释放和半胱天冬酶的激活[33]。半胱天冬酶是参与凋亡的最重要的酶，其水解细胞的重要结构和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。半胱天冬酶在细胞中为无活性的酶原，需要被激活才能发挥作用。当受到辐射后，细胞内ROS过量积聚，ROS的产生也被证明可以释放Cyt-C，激活caspase级联通路，进而导致细胞凋亡[34-35]。Mansour等发现，辐射暴露后HepG2细胞内MDA水平的显着增加且伴随caspase-3的激活[36]。Li等表明[37]，辐射引起大鼠海马组织损伤是通过ROS的产生来介导的，表现为caspase-3水平升高，均证明氧化应激在辐射诱导的组织损伤中的作用。而NAC可通过阻止caspase-3的活化，阻止细胞凋亡的下游信号传导[38]。在本实验中NAC预处理通过阻止caspase-3的活化，减少辐射诱导的神经元凋亡。

综上所述，NAC可通过抑制辐射后神经元细胞的氧化应激减少细胞内凋亡蛋白的含量，从而减少细胞凋亡。因此NAC可能是未来治疗辐射相关认知功能障碍的潜在治疗手段。