不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃发酵参数和菌群结构的影响

王祖艳 曲永利* 张 帅 刘春龙

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 2163319；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心，哈尔滨 2150081)

青贮饲料是奶牛饲粮的主要成分，能够为其提供大部分营养。全株玉米青贮的制作质量直接关系到反刍动物的健康、生产性能以及养殖场的经济效益[1]。全株玉米具有蛋白质和淀粉含量较高以及较好的适口性等优良特性，可以单独发酵制成优质青贮饲料，可被用来替代反刍动物饲粮中精料部分[2]，是我国常用的粗饲料。目前，可以利用青贮添加剂增强发酵，提高青贮的成功率，解决青贮制作问题，进而解决饲料缺乏时期的饲料供应和满足反刍动物营养需要[3]。许多学者对全株玉米青贮进行了大量研究，为更高效地保证和提高饲料青贮品质、缩短发酵时间并稳定青贮饲料的品质[4-7]，常常在制作青贮时使用添加剂[8-10]。目前，多种类型的青贮添加剂已经实现商品化。而本试验中使用的添加剂是在生产实践中被广泛应用的3种添加剂，菌制剂具有生物防治剂和生物防腐剂功能，还具有益生菌的功能，饲喂添加菌制剂处理的青贮对反刍动物瘤胃有一定的影响[11]；有机酸制剂可抑制有害微生物的生长，抑制青贮原料的腐败变质，因此广泛应用于青贮饲料的制作中，其有助于保存青贮饲料中的蛋白质和能量，可提高家畜的采食量和产奶量[12]；菌酶复合制剂可以改善青贮品质，改善反刍动物瘤胃内发酵过程，提高挥发性脂肪酸(VFA)含量和瘤胃内消化率以及动物生长性能[13]。不同添加剂处理对全株玉米青贮均具有一定的作用，但对动物生产性能的影响结论尚不统一，并且对奶牛瘤胃菌群的影响研究鲜有报道。因此，本试验拟研究不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛生长性能、瘤胃发酵参数及瘤胃微生物功能菌群的影响，旨在为牧场选择适宜的青贮添加剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮原料为黑龙江省黑河市某大型规模化牧场种植地，品种为先达101，处于蜡熟期的全株玉米，其营养水平见表1。添加剂为菌制剂(山东某生物工程股份有限公司，以乳酸片球菌、植物乳杆菌为主，活菌数≥2.0×108CFU/g)、有机酸制剂(四川某生物科技股份有限公司，含甲酸、甲酸铵、丙酸、丙酸铵等，有机酸及其盐含量≥80%)、菌酶复合制剂(山东某生物工程股份有限公司，含乳酸片球菌、植物乳杆菌和纤维素酶等，活菌数≥2.0×1010CFU/g，酶活力≥20 000 U/g)。全株玉米收割切短，长度2～3 cm，迅速填入青贮窖取不同添加剂溶于水，用喷雾器将青贮复合添加剂均匀地喷洒在青贮表面，其中对照组(CK组)不添加任何添加剂，有机酸组(OA组)按照1.0 g/kg添加有机酸制剂，乳酸菌组(LAB组)按照0.4 g/kg添加乳酸菌制剂，菌酶复合制剂组(LABE组)按照1.0 g/kg添加菌酶复合制剂。随后进行反复碾压，压实后覆上青贮膜和压窖轮胎完成封窖，青贮发酵90 d后进行饲用。

表1 全株玉米青贮营养水平(干物质基础)

1.2 试验设计

本试验于黑龙江省黑河市某大型规模化牧场进行。选择2～4胎次、泌乳期(105±5) d、体重、产奶量等相近的健康荷斯坦奶牛80头，采用完全随机试验设计，分为4组(CK组、OA组、LAB组和LABE组)，每组20头，分别饲喂无添加剂全株玉米青贮饲粮、添加有机酸制剂全株玉米青贮饲粮、添加菌制剂全株玉米青贮饲粮、添加菌酶复合制剂的全株玉米青贮饲粮，4组均自由采食。试验期共70 d，其中预试期10 d，正试期60 d。

1.3 指标测定

1.3.1 生长性能指标测定

干物质采食量测定：试验期内每天准确称量并记录给料量和剩余料量，计算每头牛每天的平均采食量。

干物质采食量=(实际给料量×干物质含量-剩余料量×干物质含量)/奶牛头数。

产奶量测定：每组随机选取10头体重相近的奶牛，正试期每天记录产奶量。

1.3.2 瘤胃液采集及瘤胃发酵参数测定

于正试期第60天晨饲前，每组选取3头体重相近的健康奶牛，用口腔导管进行瘤胃液采集，抽取前100 mL瘤胃液弃掉，将采集的瘤胃液过滤后分装到5 mL离心管中并保存于-20 ℃冰箱待测，每头每天采集200 mL瘤胃液。

瘤胃液pH使用精密型pH测量计测定；氨态氮(NH3-N)含量参照冯宗慈等[14]改进的方法进行测定；VFA含量待瘤胃液解冻后采用气相色谱仪进行测定，取5 mL在12 000 r/min离心10 min，取1.5 mL上清液至离心管中，加0.15 mL 25%偏磷酸，振荡摇匀，静置30 min后在16 000 r/min离心15 min，再用0.45 μm水相滤膜过滤上清液保存待测。其中色谱柱规格为：300 mm×7.8 mm×5 μm；流动相：2.5 mmol/L硫酸水溶液；流速：0.55 mL/min；柱温：55 ℃；检测器：示差检测器，温度27 ℃；进样量：5 μL。

1.3.3 瘤胃菌群DNA样品提取、扩增及测序

每组选择3头健康的奶牛于试验期的第1、30和60天晨饲前用口腔导管进行瘤胃液采集，抽取前100 mL瘤胃液弃掉，每头每天采集20 mL，装于无菌冻存管中于液氮中保存。样品采集完成后用提取试剂盒提取总DNA，采用Nanodrop对DNA进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；引物上添加测序接头和样本特异性Barcode序列，进而扩增16S rDNA 序列的V3～V4区，上游引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。将PCR扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。根据荧光定量结果，按照每个样本所需的数据量进行混样，测序服务、数据库的构建及统计分析均由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.3.4 序列分析

根据index和Barcode信息，对库和样本进行划分，去除barcode序列。按照Vsearch分析流程进行97%的相似度对序列进行操作分类单元(OTUs)聚类，并对OTUs进行分类学注释。

1.4 统计分析

试验数据使用Excel 2013初步处理后，使用统计软件SPSS 20.0中的one-way ANOVA进行单因素方差分析，差异显著则采用Duncan氏法进行多重分析，结果以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛生产性能的影响

由表2可知，OA组、LAB组、LABE组干物质采食量均有所提高，但与CK组相比差异不显著(P>0.05)。

表2 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛干物质采食量的影响

由表3可知，LABE组、OA组产奶量显著高于CK组(P<0.05)，分别提高了5.4%、4.5%。

表3 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛产奶量的影响

2.2 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃发酵参数的影响

由表4可知，不同添加剂处理的全株玉米青贮对瘤胃内pH、NH3-N、总挥发性脂肪酸(TVFA)、丁酸含量和乙酸/丙酸无显著影响(P>0.05)；对乙酸含量有极显著影响(P<0.01)，LABE组乙酸含量极显著高于OA组和LAB组(P<0.01)；对丙酸含量有显著影响(P<0.05)，LABE组丙酸含量显著高于OA组和LAB组(P<0.05)，与CK组差异不显著(P>0.05)。

表4 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃发酵参数的影响

2.3 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃菌群结构的影响结果

2.3.1 PCR扩增结果

提取的瘤胃液用PCR扩增总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，并对产物进行扩增。结果见图2，可发现扩增条带明显，PCR扩增效果较好，条带单一明亮，可用于后续分析。

1～9为CK组瘤胃液样品，10～18为LABE组瘤胃液样品，19～27为LAB组瘤胃液样品，28～36为OA组瘤胃液样品，M为电泳Marker。

2.3.2 瘤胃液菌群Alpha多样性分析

由表5可知，4组间Chao1、Observed species、Simpson指数均差异极显著(P<0.01)，各组的覆盖率均高于0.99，说明测序数据覆盖程度较好，足够体现试验中每头奶牛瘤胃菌群情况。由此可以看出，LABE组瘤胃液微生物丰度最高，OA组次之，CK组最低，说明不同添加剂处理的全株玉22米青贮对奶牛瘤胃微生物多样性具有显著的影响，添加剂处理的全株玉米青贮可以使奶牛瘤胃微生物多样性得到改善，有益奶牛瘤胃健康。

表5 奶牛瘤胃微生物多样性指数统计结果

2.3.3 微生物菌群物种丰度分析

不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃液菌群门水平上的组成和相对丰度如表6、图3所示，由图可知瘤胃液菌群总共含有30个细菌门类，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)为奶牛瘤胃液的优势菌门，各组菌门相对丰度均无显著差异(P>0.05)，LABE组厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度之和最高，其中3个试验组奶牛瘤胃液厚壁菌门相对丰度均高于CK组，变形菌门(Proteobacteria)相对丰度均低于CK组。

Firmicutes：厚壁菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；Tenericutes：柔膜菌门；Actinobacteria：放线菌门；Spirochaetes：螺旋体门；Cyanobacteria：蓝藻门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Fibrobacteres：纤维杆菌门；Synergistetes：互养菌门；Fusobcteria：梭杆菌门；Elusimicrobia：迷踪菌门；Chloroflexic：绿弯菌门；Lentisphaerae：黏胶球形菌门；Acidobacteria：酸杆菌门；Deferribacteres：脱铁杆菌门。

表6 奶牛瘤胃微生物门水平相对丰度

不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃液菌群在属水平上的组成和相对丰度如表7和图4所示。瘤胃液菌群总共含有526个细菌属类，由表7可知，奶牛瘤胃液菌群属水平主要包括普雷沃菌属(Prevotella)、产琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、粪球菌属(Coprococcus)、月形单胞菌属(Selenomonas)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、毛螺旋菌科下一属(Shuttleworthia)、梭菌属(Clostridium)、类普雷沃氏菌科下一属(YRC22)、颤螺旋菌属(Oscillospira)等。由图4可得，各组间主要优势菌属为普雷沃菌属，各组间琥珀酸菌属、丁酸弧菌属、粪球菌属、月形单胞菌属、假丁酸弧菌属、毛螺旋菌科下一属相对丰度均无显著差异(P>0.05)。3个试验组梭菌属相对丰度极显著低于CK组(P<0.01)，类普雷沃氏菌科下一属相对丰度极显著高于CK组(P<0.01)，LAB组和OA组颤螺旋菌属相对丰度显著高于CK组(P<0.05)，与LABE组差异不显著(P>0.05)。

Prevotella：普雷沃菌属；Succiniclasticum：产琥珀酸菌属；Butyrivibrio：丁酸弧菌属；Coprococcus：粪球菌属；Selenomonas：月形单胞菌；Pseudobutyrivibrio：假丁酸弧菌属；Shuttleworthia：毛螺旋菌科下一属；Clostridium：梭菌属；YRC22：类普雷沃氏菌科下一属；Oscillospira：颤螺旋菌属；Succinivibrio：琥珀酸弧菌属；Sharpea：沙皮菌属；Anaerovibrio：厌氧弧菌属；Treponerna：密螺旋体属；Lactobacillus：乳杆菌属；Bifidobacterium：双歧杆菌属；Moryella：莫耶拉菌属。

表7 奶牛瘤胃微生物属水平相对丰度

3 讨 论

3.1 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛生产性能的影响

干物质采食量越多，摄入营养越多，生产性能越高，与饲粮组成、适口性和奶牛自身新陈代谢等因素有关，其中饲粮组成是影响奶牛干物质采食量的主要因素[15-16]。在本试验中，饲喂奶牛不同添加剂处理的全株玉米青贮，不改变饲粮的组成结构，结果显示3个试验组的干物质采食量都高于CK组，但无显著差异。这与Ellis等[17]在青贮饲料中添加不同菌剂饲喂奶牛对奶牛干物质采食量及中性洗涤纤维、脂肪消化率均无显著差异的结果相似，这一结果的产生可能是奶牛对不同添加剂发酵处理产生不同程度的酸香味不敏感有关。

产奶量是奶牛生产性能的重要指标之一，其与饲料的营养成分有关系[18]，Cheli等[19]总结了1990—1995年期间发表的有关青贮添加剂使用效果的文章，其中28%的研究结果提高了干物质采食量，47%的结果提高奶牛产奶量。傅彤[20]和杲寿善[21]的研究也表明，产奶量显著提高，这与本试验结果一致，说明添加剂对产奶量具有积极作用。还有研究表明，饲粮中蛋白质含量也是影响奶牛产奶量的原因之一，本研究试验组青贮蛋白质含量均高于CK组，其中LABE组蛋白质含量最高，产奶量也最高，可见蛋白质的含量会影响奶牛产奶量。这可能是乳酸改变瘤胃微生物的菌群结构，提高蛋白质的吸收利用，使产奶量增加。

3.2 不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃发酵参数的影响

衡量瘤胃发酵以及微生物代谢平衡的一个重要指标是反刍动物瘤胃液pH[22]，影响瘤胃微生物的活性的原因一部分取决于pH的高低[23]，有研究表明，反刍动物瘤胃液的pH介于6.5～6.8最佳，而本次试验中，各组奶牛瘤胃液pH都在范围之内，因此能够保证奶牛正常的瘤胃内环境，这说明不同添加剂处理的全株玉米青贮饲喂奶牛对奶牛瘤胃pH无显著影响，这与王光华[24]的研究结果一致。本试验中各组NH3-N含量均在13～15 mg/mL，处于NH3-N含量的适宜范围内，能为微生物生长以及微生物蛋白合成提供适宜的含量范围，与Arroauy等[25]和Wickersham等[26]的研究结果一致，表明其可以满足奶牛瘤胃微生物的生长所需。TVFA由经饲料中的碳水化合物发酵产生，为奶牛日常生长发育提供所需总能量的70%～80%，主要受饲粮组成及结构、瘤胃微生物和瘤胃pH的影响。TVFA主要由乙酸、丙酸和丁酸组成，乙酸有利于动物的体脂率和乳脂率提高，丙酸有利于葡萄糖转化和储存，丁酸可为机体各组织供能。本研究结果表明，与CK组相比，OA组和LAB组乙酸含量显著降低，LABE组乙酸含量最高，LABE组丙酸含量显著高于OA组和LAB组，但各组间乙酸/丙酸和TVFA含量没有显著差异，这可能是瘤胃微生物中降解菌的数量和活性不同导致。其中LABE组乙酸、丙酸以及TVFA含量相对较高，说明菌酶复合制剂处理的全株玉米青贮可以改变瘤胃发酵类型。

3.3 饲喂不同添加剂处理全株玉米青贮对奶牛瘤胃菌群结构的影响

反刍动物瘤胃中菌群丰富多样，在种和属水平上尤为突出，分别包含5 200多个OTUs和3 500多个OTUs[27-28]。其中，在门水平上拟杆菌门和厚壁菌门以及变形菌门是反刍动物瘤胃内的主要微生物菌群[29]。在本研究中，3个试验组中门水平上奶牛瘤胃中厚壁菌门相对丰度最高，其次为拟杆菌门和变形菌门，这一结果与Zhang等[30]和Cunha等[31]报道一致。在属水平上，普雷沃菌属、产琥珀酸菌属、丁酸弧菌属、粪球菌属属于瘤胃内的优势菌属。普雷沃菌属是反刍动物瘤胃及胃肠道内的蛋白质降解菌，其促进非纤维多糖和果胶的降解[32]。

在本试验中，属水平上普雷沃菌属、产琥珀酸菌属相对丰度与CK组相比没有显著差异，但均有所升高，丰度最高的分别为LABE组和OA组。本试验菌群相对丰度的差异主要是梭菌属、YRC22和颤螺旋菌属，梭菌若大量繁殖，产生毒素通过改变小肠黏膜的通透性进入血液导致毒血症，还可导致真胃出血性炎症、胃肠黏膜充血等，这些都被称之为梭菌病，当奶牛从环境中食入大量梭菌时可导致梭菌病的发生[33-34]。3个试验组的梭菌属相对丰度均显著低于CK组，这可能是不同添加剂处理减少了青贮饲料中梭菌属相对丰度，从而降低瘤胃中梭菌属相对丰度。YRC22属于拟球杆菌目(Bacteroidales)，Paraprevotellaceae科，属分类名无注释且目前无相关研究报道，故无法获知其实际的生物学功能。

4 结 论

酸制剂和菌酶复合制剂处理的全株玉米青贮对奶牛生长性能、瘤胃发酵和瘤胃菌群结构有不同程度的有益作用，其中添加菌酶复合制剂可调节奶牛瘤胃中乙酸、丙酸含量，并改变瘤胃发酵类型。瘤胃微生物中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门始终为优势菌门。不同添加剂处理全株玉米青贮均可提高奶牛瘤胃菌群多样性，有利于奶牛胃肠道健康，并对瘤胃菌群具有调节作用，且菌酶复合制剂添加效果最佳。