前列腺癌异质性转化PDX 模型研究进展

师长宏

(空军军医大学实验动物中心,西安 710032)

前列腺癌(PCa)是全球男性第二大恶性肿瘤,异质性是其主要临床特征[1]。虽然雄激素剥夺可有效控制肿瘤生长,但最终会形成去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),进一步雄激素受体(AR)靶向治疗在延长患者生存期的同时会诱导神经内分泌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC) 和侵袭变异性(aggressive variant,AVPC)前列腺癌,出现特征性骨转移,导致难以治愈[2]。驱动Pca 发生系列转化的分子机制并不是很清楚,主要是缺乏模拟临床特征的异质性转化模型。本文就前列腺癌的临床异质性进行总结,综述基于临床肿瘤病人异种移植(patient derived xenograft,PDX)模型的研究进展,重点关注急需的Pca 异质性转化模型,以期为Pca 的转化机制研究和靶向药物筛选提供理想的动物模型。

1 前列腺癌具有独特的异质性,需要体内模型展示其进展转化特征

前列腺癌发生和发展的重要因素是雄激素传导信号。手术或药物去势是进展性PCa 患者标准治疗方式,然而,大多数PCa 患者最初对雄激素剥夺治疗有积极反应,但在去势2 ～3 年后病情复发,进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)[2]。此时肿瘤细胞为了生长和存活由对雄激素具有不同程度依赖性的混合细胞组成,具有较强的异质性[3](图1)。在CRPC 中,疾病进展最常见的是雄激素受体(androgen receptor,AR)信号的再激活,此时,多西紫杉醇或新一代雄激素受体抑制剂,如恩杂鲁胺(ENZ)和阿比特龙(ABI)被用于CRPC 的治疗,在显著提高生存率和生活质量的同时,大多数患者最终会对这些药物也产生耐药性,诱导出现NEPC 的转化和AVPC[4],导致临床难以治愈。因此,雄激素剥夺治疗在诱导Pca 异质性转化中发挥了最重要作用。

NEPC 是 PCa 的一种恶性突变,保留了早期PCa 基因组特征并获得新的分子变化,此时AR 信号减弱,具有高进展风险,包括促使转移的发生。雄激素阻断是导致患者NEPC 发生的重要原因,已证实 CRPC 病人治疗后发生的 NEPC 克隆来自CRPC-腺癌前体,而不是预先存在的NEPC 克隆,可以基于不同的分子改变将CRPC-NEPC 从CRPC-腺癌中区分出来[5]。Beltran 等[6]对患者进行了前列腺切除术,发现伴有局部淋巴结受累,最初采用雄激素剥夺(androgen deprivation therapy,ADT)治疗,然后在发生转移和去势抵抗时进行化疗,数月后,骨盆软组织活检发现已进展为NEPC。

AVPC 又称间变性前列腺癌,在临床上被定义为具有转移特征的CRPC(mCRPC),包括内脏转移、骨转移或骨盆中淋巴结转移等[7],其中骨转移最常见。临床证实具有侵袭性特征的CRPC 更适合铂治疗,如果在CRPC 进展期间能够及早检测到NEPC 改变,则可选择这些个体用于NEPC 治疗(铂化疗)而不是AR 靶向治疗[6]。因此,迫切需要与临床相似的体内模型来充分展示前列腺癌CRPC、NEPC 和AVPC 的进展转化特征,了解其异质性,开发具有针对性的治疗策略。

2 细胞系移植(CDX)模型的特征局限,缺乏异质性

PCa 的研究由于缺乏模拟临床特征的系统性模型一直受到影响。目前常用的细胞系移植(Cell derived xenograft,CDX)模型在 ATCC 已报道 1000个癌细胞系中仅有7 种Pca 细胞系[7-8],但这些细胞系和模型已应用多年,在前列腺癌发病机制和药物筛选研究方面发挥了重要作用。比如,AR 对于雄激素依赖性Pca 病情的发展至关重要,它激活雄激素后,调节前列腺特异抗原(prostate specific antigen,PSA)表达并诱导PCa 细胞的增殖,因此,Pca 细胞系应关注完整AR 的表达和雄激素依赖特性。LNCaP 是雄激素依赖的代表性细胞系,可以进一步形成AR 非依赖性的亚系LNCaP C4-2,该细胞具有突变的雄激素受体,对雄激素有反应性,分泌PSA,更具临床相关性,主要用于PCa 发病机制研究,但该细胞系在体内致瘤性差,由于雄激素受体的配体结合域中的点突变导致其对抗雄激素的反应异常,使其具有局限性[9]。“经典”模型是雄激素非依赖性的PC3 和DU145 细胞系,前者源于人PCa的骨转移瘤,后者具有较低的转移潜能,来源于人PCa 的脑转移瘤,这两种细胞裸鼠移植成瘤性较好,主要用于体内筛选实验研究,但二者均缺乏AR 和PSA 的表达[10]。22Rv1 细胞源于原发性 PCa 骨转移瘤,属于雄激素非依赖性但具有雄激素反应性,表达AR,但PSA 低表达,可在裸鼠体内形成肿瘤。NCI-H660 源于前列腺癌淋巴结转移灶,属于雄激素非依赖性,半悬浮生长,形态为上皮神经内分泌样,AR 和PSA 表达均为阴性。上述细胞系均只体现了前列腺癌某个阶段特征,许多临床表型未在细胞系中出现,代表性有限,作为临床前研究模型不甚理想[7]。在临床多见的CRPC 病人中,治疗的巨大选择压力可导致前列腺癌异质性显著增加,比如AR和PSA 表达水平的变化,雄激素受体的突变,NEPC表型的出现等。因此,需要大量不同的CRPC 系列模型来代表不同的抗性机制[9],尤其是动态模型来体现其转化特征。而CDX 模型仅体现出临床病人某一阶段的静态特征,在模拟前列腺癌多样性和疾病进展过程方面明显不足,因此,发展一种基于同一标本能够诱导反映前列腺癌转化全部过程的模型就成为当前研究的必然趋势。

图1 前列腺癌临床异质性特征Figure 1 Clinical heterogeneity character of prostate cancer

3 PDX 模型具有原发瘤的主要特征,但未能有效体现其临床异质性转化

将Pca 病人新鲜的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠建立的原发性PDX(patient derived xenograft)模型较好地保持了原发瘤的异质性[11]。由于植入免疫缺陷小鼠的Pca 瘤组织是对雄激素具有不同程度依赖性的混合细胞组成,在未处理的雄性小鼠中,雄激素依赖性细胞有生长优势并最终发展成雄激素敏感的移植模型;雄激素非依赖的肿瘤细胞在去势小鼠体内生长,显示去势抗性,最终表现为激素依赖(hormone naïve primary prostate cancer,HNPC)或CRPC 特征。该类模型可用于基因组和转录组的分析,评估人PCa 中异常遗传变化和基因谱,研究模型对雄激素剥夺和多西他赛等药物治疗的反应[12-13]。基因组表征显示,在PCa 患者中检测到的特定基因组异常,例如PTEN 抑制基因的突变和特定基因的遗传改变在PDX 移植瘤中很普遍,因此该类模型适合于阐明Pca 的发生机制[14]。目前,前列腺癌PDX 模型总体成功率较低(10% ～30%),首代成瘤时间最长为12 个月,再次传代需要4 ～16周[15]。大多数前列腺癌PDX 模型为原发性激素依赖型,缺乏模拟临床特征的CRPC 转化模型。

4 雄激素剥夺可诱导前列腺癌PDX模型发生CRPC 和NEPC

2016 年 ～2017 年Prostate 连续发文报道了前列腺癌KuCaP 系列[16]和LuCaP 系列[17]PDX 模型,去势后可发生 CRPC 和 NEPC 的转化,提示诱导PDX 模型发生转化的可行性。KuCaP 系列PDX 模型来自不同类型的Pca 临床标本,移植于SCID 小鼠形成肿瘤模型[16]。KuCaP1 来自雄激素抵抗的PCa患者肝转移标本,AR 突变为W742C,移植小鼠去势后肿瘤快速消失,长时间不再复发,AR 和PSA 阳性,为雄激素依赖性PDX 模型。KuCaP2 来自于经根治性前列腺切除术后的局部复发肿瘤,雄激素依赖,携带野生型AR,产生PSA,去势后肿瘤快速消退,1 ～ 2 月后重新生长,发展为 CRPC。KUCaP3 来自CRPC 患者,移植小鼠去势后快速消退,多月后重新生长,模拟临床 CRPC 症状,AR 和 PSA 表达阳性,神经内分泌标志物CGA 阳性,具有人类NEPC特征。LuCaP 系列来自转移灶的外科手术标本,包括了21 种PCa PDX 模型,初始生长时间从4 个月到12 个月[17]。一些PDX 模型肿瘤在去势后消退,还有一些去势后重新生长的肿瘤植入去势小鼠,建立去势抗性模型。该系列模型重现了肿瘤患者组织学特征,包括分化良好的腺癌,低分化腺癌和神经内分泌癌[18]。代表了人类Pca 的主要基因组和表型特征,包括雄激素受体的扩增,PTEN 缺失,TP53 缺失和突变,RB1 缺失,反映了CRPC 的多样化分子组成。

模拟临床手术去势是诱导前列腺癌PDX 模型发生CRPC 的重要手段。Hao 等[19]将10 例雄激素依赖性PDX 模型进行去势手术,肿瘤体积急剧减小,血清 PSA 水平降低。12 周后,7 例重新生长,血清中PSA 水平增加,形成与临床ADT 手术病人相似的CRPC,同时发现生长因子受体结合蛋白10(GRB10)驱动了CRPC 的发生。KuCaP2 移植瘤小鼠去势后肿瘤快速消退,1 ～2 月后重新生长,发展为CRPC,Array 分析发现前列腺素E 受体EP4 亚型表达显著上调,特异性EP4 拮抗剂可用于CRPC 治疗[20]。提示诱导发生CRPC 的PDX 模型可为临床CRPC 的治疗提供新靶点。

Lin 等[21]成功建立了可以由ADT 诱导的前列腺癌向NEPC 转化的前列腺癌PDX 模型LTL331,原发模型是典型的腺癌,在雄激素刺激下表达AR和PSA,去势后可出现抗性生长并转化为NEPC 特征的LTL331R,表达一系列神经内分泌标志物,包括SYP ( Synaptophysin), CGA ( ChromograninA) 和CD56。当移植到未去势和去势的小鼠,LTL331R 保留其NEPC 表型和雄激素非依赖性生长,这表明NEPC 转化的稳定和不可逆性[14]。该研究进一步发现胎盘基因PEG10(growth factor receptor bound protein 10)在转化过程中表达显著升高,NEPC 分化过程中PEG10 受AR 和E2F/RB 信号分子动态调控,并且PEG10 促进NEPC 细胞的增殖和侵袭[22]。同样,Jongsma 等[23]将雄激素依赖性前列腺癌异种移植物PC-310,经过长时间的雄激素剥夺处理后,也可分化出现NEPC 表型。

5 PDX 转化模型少有临床常见骨转移特征

AVPC 的主要特征是形成转移性前列腺癌,目前尚无有效的治疗方法,缺乏对疾病进展机制的了解[7]。转移的发生受肿瘤内在因素和移植微环境的共同影响,在mCRPC 阶段出现特征性成骨细胞骨转移是造成PCa 发病和死亡的主要原因。现有的前列腺癌PDX 模型少有骨转移的发生,主要是因为Pca 骨转移的发生不仅受肿瘤内在因素的影响(具有骨转移潜能),而且受促进肿瘤细胞亚群转移的微环境控制[12]。MDA-PCa-118a 和 MDA-PCa-118b 均来自PCa 骨转移标本,移植于去势的雄性裸鼠皮下可以生长,组织病理学分析显示移植瘤周围被成骨细胞组成的骨基质包围,骨与肿瘤交界处存在成骨细胞、钙化基质和破骨细胞[24]。注射到SCID 小鼠的股骨表现出强烈的成骨细胞反应,诱导新生骨形成,但没有观察到与临床相似的骨转移发生。将来自LuCaP 的PDX 肿瘤细胞直接注射到小鼠胫骨中,发现只有部分能在骨中增殖,同样,该模型也不能自发地从皮下转移到骨[25]。目前所有可用的成骨细胞骨转移模型都是雄激素响应,但是,是否需要雄激素受体用于PCa 细胞诱导新骨形成,以及诱导的新骨如何影响PCa 细胞在骨的生长和存活,相应机制尚不完全清楚,主要是因为很少有模型重现PCa 与骨的相互作用[15]。

6 展望

6.1 AR 抑制剂可能诱导PDX 模型发生NEPC 和AVPC 的转化

目前针对NEPC 的治疗效果不佳,由于缺乏相应的转化模型,无法深入研究NEPC 表观遗传特性,使得NEPC 临床诊断变得困难[6]。如果能够利用PDX 模型复制Pca 从腺癌到NEPC 的演变则可以深入揭示NEPC 的发生机制,评估肿瘤对NEPC 靶向药物的反应,阐明Pca 进展和治疗抵抗的机制。KuCaP 和LuCaP 两种系列PDX 模型虽然具有前列腺癌主要临床特征,但未能有效体现NEPC 复杂的转化过程。由于临床Pca 病人大部分通过治疗存在雄激素依赖向非依赖的转化,因此,理想的前列腺癌PDX 模型应该是通过控制雄激素,模仿临床的主要特征,即 CRPC 和 NEPC 复杂的转换过程[23]。AR 信号是前列腺发育过程中上皮细胞分化所必需的因素,其抑制剂可促发前列腺癌细胞重编程,通过转分化机制发展为NEPC。所以,AR 靶向药物用于CRPC 的治疗,在提高病人存活期的同时,大多数患者会产生耐药,诱导NEPC 和AVPC 的发生。新型的AR 靶向药物阿比特龙(或是恩杂鲁胺)被批准用于临床 CRPC 的治疗,但大多数患者会诱导NEPC 和 AVPC 前列腺癌的发生,产生耐药性[7]。因此,AR 靶向抑制剂可诱导前列腺癌PDX 模型发生NEPC 和 AVPC 转化。

6.2 筛查骨转移潜能标本,进行原位移植促进前列腺癌骨转移的发生

根据基因型特征筛选具有转移潜能的前列腺癌标本可能促发骨转移。Y 染色体特有的去甲基酶JARIDID 具有抑制前列腺癌侵袭的作用,其机制为JARIDID 可特异性结合侵袭转移相关基因的启动子,抑制转移的发生,实验证实在转移性 Pca 中JARID1D 的表达通常是缺失的[26-27]。单胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAOA)是线粒体膜结合酶。已证实MAOA 是通过激活肿瘤基质中的旁分泌Shh 信号,成为临床上PCa 骨和内脏转移的重要介质[28]。MAOA 通过刺激IL-6 从成骨细胞释放,利于骨微环境中的肿瘤细胞生长,并通过成骨细胞产生核因子κ B 受体活化因子配体RANKL(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand)和 IL-6 活化破骨细胞,触发骨骼定植[29]。已证实MAOA 高表达的前列腺癌标本具有强的骨转移潜能。成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor 9,FGF9)是FGF 家族的成员之一,在前列腺癌细胞中表达[30]。骨转移标本MDA PCa 118a 和118b 植入后SCID 小鼠股骨后诱导了强烈的成骨反应,基因表达谱显示FGF9 是上调最多的基因,诱导成骨细胞增殖[22]。联合进行上述三个基因的筛查可能获得高转移潜能的PDX 模型

前列腺癌转移的发生与移植微环境密切相关。无论是小鼠肾包膜移植还是皮下移植,都少有骨转移的发生。Wang 等[31]报道将Pca 患者的肿瘤组织移植到补充有睾酮的雄性NOD-SCID 小鼠肾包膜。连续移植5 次后,将瘤组织移植到小鼠前列腺中,将淋巴结转移灶(Pca-met-1)再次移植小鼠前列腺中,可发生多个器官转移,包括肺、肝、淋巴结和骨,出现溶骨现象,AR 和PSA 的表达与原发瘤一致,提示前列腺原位移植是促发Pca 骨转移的重要条件。

6.3 理想的PDX 模型应完整反映前列腺癌进展各阶段的生物学特征

与其他肿瘤相比,前列腺癌PDX 模型数量较少,能够形成一系列模拟疾病进展的模型更有限,且关于前列腺癌PDX 模型的数据库尚不完善。虽然AR 信号是调控Pca 异质性转化的重要因素,但缺乏其调控骨转移的直接证据,主要是缺乏与临床相近的Pca 模型来动态展示雄激素依赖到非依赖直至骨转移的发生。

已报道的KuCaP 系列和LuCaP 系列PDX 模型也具有部分临床转化特征,但均为各个阶段的孤立模型,形成不同的系列组合,不能完整反映Pca 临床转化进程,且未发生骨转移;上述模型的标本来自进展性或转移病人,仅代表一小部分癌症表型,不能完全概括其异质性[27];一些模型缺乏Pca 细胞的标志,如 AR 和 PSA 的表达[6]。因此,完整的模拟临床特征的动物模型应反映PCa 进展的早期阶段至晚期直至转移期的生物学特性,包括CRPC 的发生、从腺癌到NEPC 的转化以及转移的发生,特别是同一标本能够诱导转化反应的全部过程,获得配对比较模型,用于基因型和表型的比较研究,探索其异质性发生的机制。