小麦剩余杂合体株高的基因定位

张俊杰，吉万全，张耀元，张 宏，陈春环

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

小麦是世界上重要的粮食作物之一[1]，但小麦植株过高容易倒伏，进而滋生病虫害，影响小麦生长，导致小麦籽粒灌浆不足，产量降低[2]。因此，选育矮秆抗倒伏小麦品种对提高小麦产量具有重要意义。

迄今为止，已经发现24个控制小麦矮秆性状的基因，在已知的小麦矮秆基因家族中，最受关注且应用最广泛的基因是Rht1、Rht2和Rht8[3-4]，世界上超过半数的矮秆小麦品种都带有Rht1和Rht2这两个矮秆基因[5-7]。Rht1、Rht2、Rht3和Rht10基因已成功被克隆[8-9]，其他20个Rht基因也在育种中得到不同程度地利用[1，10-11]。其中Rht9基因在育种中应用规模较小[12]；Rht4、Rht5、Rht6、Rht7等基因虽然能够显著降低小麦植株高度，但会导致小麦产量大幅度降低，不利于实际生产应用[13-14]。Goudia等[15]通过生物技术手段对Rht5基因进行优化改造，使Rht5基因的应用潜力得到提升。Li等[16]发现，Rht11基因只在欧洲小麦育种中被广泛利用。目前在小麦基因家族中，Rht24基因广泛分布于全球各个地区，在世界各地的小麦育种中都有利用[17]。

随着现代分子技术的快速发展以及测序成本显著下降，BSR-Seq技术成为植物目标性状基因定位的主要手段，如玉米蜡质调控基因gl3[18]、根毛生长调控基因Rht5[19]、叶脉发育调控基因bm2[20]、小麦的黄锈病抗性基因Yr15[21]、高谷蛋白含量基因GPC-B1[22]、洋葱的雄性不育育性恢复候补基因AcPMS1[23]、萝卜的育性恢复基因Rfd1[24]等均采用此方法进行定位。

近等基因系(near-isogenic line ,NIL)是指通过亲本之间的反复杂交获得的遗传背景相同而个体特征不同的种系。因此，近等基因系可以快速、准确地定位到目标性状QTL[25-26]。剩余杂合体(residual heterozygous line,RHL)相当于近等基因系材料配对杂交产生的F1,收获自交种子得到在目标区间呈杂合型、而其余区间均为纯合型的遗传材料。因此，从某种意义上说，剩余杂合体就是近等基因系的一个扩展[27]。

本研究以小麦品种品冬34和Warran杂交构建的重组自交系(recombinant inbred lines,RIL)群体为材料，于F7:8代筛选出一个株高性状分离的剩余杂合体，并利用BSR-seq技术对该剩余杂合体分离出的高株与矮株纯系分别混池测序，进行株高基因位点的初步定位，并对预测区段内候选基因进行功能预测，以期为今后开展小麦株高基因挖掘与功能分析以及小麦矮秆品种的选育奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验室前期以矮秆小麦品种品冬34为母本，以高秆小麦品种Warran为父本杂交构建了RIL群体。品冬34是中国农业科学院作物品种资源研究所选育品种，具有矮秆、千粒重高等优良品质。Warran是国外引进的小麦种质资源，具有高秆、千粒重低的特征。从该RIL群体F7:8代中筛选到一对株高分离的剩余杂合体，并获得高株和矮株纯系(命名为658高/矮近等基因系，即658 H/D NILs)，分别于2017-2018、2018-2019和2019-2020年度种植于西北农林科技大学小麦试验基地，行距24 cm，株距10 cm，每行10株，658 H/D NILs亲本各4行。其中，2018-2019年度，658高株和矮株NILs纯系杂交得到F1代，2019-2020年度，F1自交得到F2分离群体。

1.2 样品取样与BSR测序

于小麦起身期、拔节期和抽穗期，分别在658高株和658矮株NILs主茎的各节间取样，长度约为1.00 cm，液氮冷冻，-80 ℃保存待用。分别将658高株和658矮株NILs不同时期与不同节间样品混合，送北京诺禾生物技术有限公司进行RNA提取和BSR-seq测序分析。

1.3 候选基因筛选与功能分析

利用KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)查阅代谢通路，利用URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)注释小麦候选基因，利用小麦多组学(Triticeae Multi-omics Center)网站(http://202.194.139.32/)进行小麦组织特异性表达预测。

1.4 数据统计分析

利用R语言进行基因初步定位与Manhattan制作，利用Excel软件进行数据收集、整理和分析。

2 结果与分析

2.1 658 H/D NILs的表型鉴定结果

如表1所示，658 H/D NILs在三个种植季的穗长、小穗数、千粒重表型数据除在2018年千粒重存在显著差异外，其余均无显著差异；采用 1 000对SSR标记对658 H/D NILs材料进行多态性分析，结果均无差异(结果未列出)，结果表明，658高株与658矮株材料遗传背景相似。在每个种植季，658高株的株高均比同一环境下的658矮株高，且658高株与658矮株间的株高差异极显著(P=0.000 532<0.01)。综上所述，658 H/D NILs材料可以用于株高的BSR-Seq分析。

表1 658 H/D NILs的田间表型数据Table 1 Field phenotypic data of 658 H/D NILs in different years

2.2 658 H/D NILs遗传群体的表型分析结果

658 H/D NILs杂交F1代的株高更趋向于658高株，表明高秆性状由显性基因控制。658 H/D NILs F2群体的株高频率呈正态分布(图1)，预测其株高性状由多基因控制。658 H/D NILs F2群体的株高基因型模型以卡方值(χ2)最小和可信度(P值)最大为最优模型，由表2可知，模型M3为F2群体最优分离模型，株高比例符合9∶7，卡方值和可信度分别为0.07和0.78(P> 0.05)，表明658 H/D NILs的株高可能由两对显性互补基因控制。

2.3 658 H/D NILs株高基因的定位结果

通过BSR-seq分析，将658 H/D NILs的株高基因定位于7B染色体687～689 Mb处(图2)。根据BSR测序结果进行差异SNP富集分析，共筛选到979个SNP位点(ED=2)(图3)，其中，7B染色体上的SNP位点数最多，为111个，在688 Mb处富集的SNP位点最多，为22个；3B染色体上的SNP位点数次之，为96个。其余染色体的差异SNP位点富集不明显。综合以上BSR-seq分析，初步预测658 H/D NILs的株高基因位于7B染色体687～689 Mb处。

2.4 BSR-seq候选基因的分析结果

通过与中国春小麦参考基因组比对，658 H/D NILs 7B染色体687～689 Mb处共有18个候选基因(表3)，其中，8个基因参与相关通路表达，TraesCS7B02G419700参与糖类代谢途径，主要完成D1磷酸葡萄糖与UDP葡萄糖之间的转化；TraesCS7B02G419500参与甘油脂类代谢通路，主要在3-磷酸甘油酸酰基转移酶通路中起作用；TraesCS7B02G419800、TraesCS7B02G419900、TraesCS7B02G420100、TraesCS7B02G420400、TraesCS7B02G420500和 TraesCS7B02G420600在溶酶体Pro-X 羧肽酶通路中参与调控。

图1 658 H/D NILs F2群体株高表型 的频率分布和正态分布情况Fig.1 Phenotypic frequency and normal distribution of plant height in F2 populations of 658 H/D NILs

表2 658 H/D NILs F2群体株高基因型模型分析Table 2 Model analysis of F2 populations of 658 H/D NIL by chi-square test

Manhattan图表示每条染色体上多态性SNP数目占总SNP数目的比例。在染色体上通过连续滑窗方式每10个ED值进行均值 计算。

图3 BSR-seq所有SNP(ED=2)在21条染色体上的分布Fig.3 Distribution of all SNP(ED=2) from BSR-seq results on 21 chromosomes

通过小麦组织特异性表达预测分析，18个候选基因中共有6个基因在茎中表达，其中TraesCS7B02G420400在茎中相对表达量最高。预测区间内的18个候选基因中，TraesCS7B02 G419700和TraesCS7B02G420400参与小麦代谢通路和茎的生长发育；而TraesCS7B02G418900、TraesCS7B02G419000、TraesCS7B02G419600和TraesCS7B02G420000只参与茎的生长发育。

表3 658 H/D NILs株高相关候选基因的信息Table 3 Annotation of candidate genes in 658 H/D NILs by mapping to the Chinese Spring wheat genome

3 讨 论

658 H/D NILs遗传背景相似、只有株高差异显著，通过R语言进行BSR-seq分析，初步预测658 H/D NILs株高基因位于7B染色体687～689 Mb处。在已经公布的24个矮秆基因中，Rht9与Rht13这两个矮秆基因均位于7B染色体上[28-29]，目前尚未克隆，利用与Rht9和Rht13基因紧密连锁的标记，在658 H/D NILs中进行检测，发现并不含Rht9和Rht13，表明控制658剩余杂合体株高的基因与已经公布的24个矮秆基因并不相同。胡文静等[30-31]、李 聪等[32]和孙阳阳等[33]等分别定位到8、3和5个控制株高的QTL，分布在2B、2D、4B、4D、5A、5B和7A染色体上。武炳瑾等[34]等共检测到9个控制株高的QTL，除了以上7条染色体外，在7B染色体23～33 cM处也定位到控制株高的QTL。因此，本研究株高定位结果与前人检测的控制株高QTL位点均不一致，可能为新的控制株高的位点。

658 H/D NILs在7B染色体687～689 Mb处共有18个候选基因，有2个候选基因参与代谢过程和小麦茎的生长发育，其中，TraesCS7B02- G420400在茎中的相对表达量较高，可以优先考虑进一步研究；4个候选基因不参与代谢过程，但在小麦茎中表达，这4个候选基因对小麦矮秆基因挖掘以及功能验证方面具有重要意义，特别是TraesCS7B02G419000。经分离模型预测分析，658 H/D NILs的株高性状由两个显性互补基因控制，推测这6个候选基因中包含这两个显性互补株高基因，但还需进一步验证。本研究利用BSR-seq技术，在658 H/D NILs中进行株高基因初步定位与候选基因功能分析，为后续株高基因的克隆以及功能验证奠定基础。同时，本研究利用BSR-seq技术与近等基因系相结合的方法进行快速基因定位，为后续挖掘更多功能基因、推动作物遗传育种提供了参考方法。