S100A7在肝内胆管细胞癌中的表达及其临床意义

陆小亮，吴 彬，陈科济，李爱军，范 飞

海军军医大学附属东方肝胆外科医院特需治疗科三病区，上海 200438

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）也被称为外周型胆管癌、胆管癌之肝内型，是肝内胆管被覆上皮发生的、起源于肝段胆管一直到赫令胆管上皮的一种原发性癌症，被定义为源于Ⅱ级以远的肝内胆管病变［1］。肝内胆管癌恶性程度高、症状隐慝，早期难以被发现，根治性切除机会较少，且发展迅速，预后不佳、死亡率高，近年来其发病率不断上升［2］。肝内胆管癌发生发展的确切机制目前尚不明确。本研究通过免疫组化、免疫印迹、PCR 方法测定S100A7 在肝内胆管癌组织及癌旁组织中的表达，并分析其与肝内胆管癌临床相关指标的关系。

1 材料和方法

1.1 临床资料

收集上海东方肝胆外科医院2018 年1 月—2020年1月收治的30例肝内胆管癌患者患者，男17例，女13 例。按国际抗癌联盟TNM 分期属Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ-Ⅳ期19例。所有患者均未行化疗、放疗和靶向、免疫治疗。

纳入标准：临床影像学诊断为肝内胆管癌，首诊于我院。排除标准：无远处转移，无手术禁忌。患者及家属均术前已签订我院标本供医学研究使用告知同意书，本研究经上海东方肝胆外科伦理会审核并批准。患者均行肝内胆管癌根治术。术后标本均经病理检查证实为肝内胆管细胞癌。

1.2 方法

运用免疫组化和real-timePCR、免疫印迹的实验方法检测S100A7 的蛋白和mRNA 在肝内胆管癌组织中的表达情况：新鲜液氮冻存的组织样本，分成2 份，一份提取蛋白，一份提取RNA。采用Invitrogen 公司的免疫组化试剂盒对30 例样本进行蛋白水平的检测；蛋白裂解液裂解组织，4 ℃下离心，获取上清、蛋白变性20 min；与细胞裂解液进行12%的SDS-PAGE 电泳，ECL 发光试剂盒显影、曝光，分析蛋白表达量；TRizol 抽提组织中的总RNA，设计针对S100A7 的特异引物，对反转录cDNA 进行real-time PCR 反应，以β-actin 为内参，检测S100A7的mRNA水平。

1.3 统计学分析

数据用SPSS 16.0 统计软件进行分析。采用Fisher 精确概率法、Linear-by-Linear Association法、Pearson Chi-square 法对S100A7 表达与相关临床相关性进行统计。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化

免疫组化检测的30 例肝内胆管癌组织S100A7表达水平。结果显示，癌组织中S100A7 染色强度、阳性百分比和Quickscore 均显著高于癌旁组织，见图1。

图1 S100A7在肝内胆管癌及癌旁组织细胞中的表达（免疫印迹法）Fig.1 The expression of S100A7 in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells（Western blotting）

2.2 免疫印迹

为验证免疫组化结果，我们用免疫印迹法检测了30 例肝内胆管癌组织标本中S100A7 表达水平。结果癌组织S100A7 蛋白表达水平亦明显高于癌旁组织，见图2。

2.3 qRT-PCR

为进一步验证S100A7 是否在肝内胆管癌高表达，我们用定量PCR检测了30例肝内胆管癌组织标本中S100A7 mRNA 表达。结果癌组织中S100A7 mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织。见图3。

2.4 S100A7表达与肝内胆管癌临床病理的相关性

本研究分析了30 例肝内胆管癌S100A7 表达与临床病理因素的相关性。S100A7表达与浸润深度，淋巴结转移和TMN 分级存在显著相关性（P＜0.05），但与患者患者的性别、年龄、淋巴管侵犯、肿瘤分化程度、远处转移无关。见表1。

3 讨论

肝内胆管癌是一种恶性程度高，较难早期发现，预后很差的恶性肿瘤。其发生可能与某些因素相关［3］如肝内胆管结石［4］、胆管分支（胆管树）形态异常、慢性感染、放射性核素及石棉、亚硝酸胺等化学性物质［5-6］。目前临床上应用的几个检查指标如癌胚抗原（CEA）、糖类抗原199（CA199）［7-9］、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、碱性磷酸酶（ALP）等为肝内胆管癌的肿瘤标志物，虽有一定特异度和灵敏度，但总体而言尚缺乏有效的临床诊治、预后判断的分子靶标，且相关基础研究较少。

我们前期通过高通量基因表达谱筛选、芯片检测及生物信息学分析，筛查出肝内胆管癌细胞存在一个显著变化的分子即S100A7（S100 calcium binding protein A7）。本文在这基础上，应用免疫组化、免疫印迹、实时定量PCR 进一步检测验证，并分析与肝内胆管癌患者的临床病理相关性。免疫组化、免疫印迹、实时定量PCR 的检测结果均显示，S100A7 在肝内胆管癌细胞中表达明显高于癌旁正常组织；而且发现，S100A7 在肝内胆管癌中表达与肿瘤浸润深度（T1、T2对T3、T4，P=0.027）、区域淋巴结转移（N0对N1-2，P=0.014）、TNM 分级（Ⅰ、Ⅱ期对.Ⅲ、Ⅳ期，P=0.021）呈正相关，提示肝内胆管癌S100A7 表达越高，其肿瘤浸润越严重，淋巴结越易转移，TNM 分期越晚，患者预后越差；但与性别、年龄、淋巴管转移、肿瘤分化程度、远处转移无关。

图2 S100A7在肝内胆管癌及癌旁组织细胞中的表达（免疫组化）Fig.2 The expression of S100A7 in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells（immunohistochemistry）

图3 S100A7 在肝内胆管癌及癌旁组织细胞中的表达（qRT-PCR）Fig.3 The expression of S100A7 mRNA in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells（qRT-PCR）

S100A7也称银屑病素，最早是在银屑病皮肤病变中被分离和发现的一个相对分子质量约11 400的低分子量蛋白，属S100家族［10］。该家族的典型结构特征是有两个螺旋基元（helix-loop-helix）组成的钙离子结合位点（calcium-binding site）［11］。在S100蛋白家族中，有22个家族成员在1号染色体21位基因座（locus）位置形成基因簇（cluster）［12］，其中也包括S100A7。S100家族成员在细胞内、外均起重要的生理功能，包括钙离子平衡、增殖、凋亡、侵袭/运动、细胞骨架变化、转录等［13］。作为S100 家族的成员，S100A7 除了上述两个具有家族特征的钙离子结合位点外，还有一个特有锌结合位点（zinc-binding site），该位点可能是介导S100A7特异性功能的关键结构域［14］。据报道，S100A7参与了众多上皮来源的恶性肿瘤［15］包括子宫癌［16］、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［17-19］的 发 生、发 展 过 程，如S100A7 通 过 调 控Hippo-YAP 通 路 促 进 肺 癌 发 生 发 展［18］。而 且，S100A7 表达受表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）信号通路的调控，并参与该信号通路的调控［20］。我们团队曾报道，microRNA-26b-5p（miR-26b-5p）可通过抑制S100A7的过度表达抑制肝内胆管癌细胞的增殖、转移［21］。然而，关于S100A7 在肝内胆管癌中的功能和分子机制研究以及与临床病理相关性，罕有报道。本文结果，S100A7 在肝内胆管癌细胞高表达，且与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、TNM 分级相关，提示可能参与了肝内胆管细胞癌的发生发展；在临床上开展检测S100A7 表达，可能助于了解肝内胆管癌患者的预后。如若进一步研究S100A7及其下游信号通路分子抑制剂，有望开发针对性的靶向药以改善患者不良预后。

表1 肝内胆管癌S100A7表达与临床病理参数相关性Tab.1 Relationship between S100A7 expression in intrahepatic cholangiocarcinoma and clinicopathological parameters