莱菔子炮制前后HPLC特征图谱 及4种成分含量变化研究

高思佳，王计瑞，秦伟瀚，王云红，程磊，阳勇，张小梅

重庆市中药研究院，重庆 400065

莱菔子为十字花科植物萝卜Raphanus sativusL.的干燥成熟种子[1]，多以炒制品入药，含硫代葡萄糖苷（glucosinolates，以下简称“硫苷”）。硫苷是存在于十字花科植物特有的次生代谢产物，多与植物细胞质中的硫代葡萄糖苷酶（芥子酶）共存[2]。研究表明，炒制不仅可抑制莱菔子中黑芥子酶的活性，阻止硫苷类成分萝卜硫苷的分解，且能引起其他化学成分的较大变化[3]。目前莱菔子炮制研究集中于炮制前后化学成分变化规律[4-7]、指纹图谱[8-9]等，而缺少对炮制温度至芥子酶彻底破坏后化学成分变化的相关研究。

本研究基于“生熟异治”“生升熟降”炮制理论，通过预试验确定莱菔子最佳炮制工艺，采用HPLC建立莱菔子生品和炒制品的特征图谱，同时测定莱菔子炮制前后特征成分萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸的含量，采用系统聚类分析（HCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对生品和炒制品特征图谱共有峰进行分析，探讨莱菔子炮制前后化学成分的变化规律，为莱菔子生品和炮制品的质量控制及其炮制机理研究提供参考。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪（Waters 2996检测器，Waters Empower化学工作站），美国沃特世科技有限公司；AEG-45SM十万分之一天平，日本岛津公司；BP121S万分之一天平，德国Sartorius公司；CY-25中药炒药机，温州顶历医疗器械有限公司；KQ-400 DE型数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司。

对照品芥子碱硫氰酸盐（批号PS011003，纯度≥98.0%）、萝卜硫苷（批号PS011849，纯度≥95.0%），成都普思生物科技股份有限公司；对照品莱菔素（批号BP1814，纯度≥98.0%）、芥子酸（批号BP1778，纯度≥98.0%），成都普瑞法科技开发有限公司。12批不同产地莱菔子样品购于重庆上药慧远药业有限公司、广东源森泰药业有限公司、康美药业股份有限公司、安徽亳州药材市场等，经重庆市中药研究院生药研究所瞿显友研究员鉴定为十字花科植物萝卜Raphanus sativusL.的干燥成熟种子，样品来源见表1。乙腈、甲醇为色谱纯，上海阿达玛斯试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂；水为超纯水。

表1 莱菔子样品来源信息

2 方法与结果

2.1 炒制品制备

取莱菔子样品S1～S12各500 g，置炒药机中，130 ℃炒10 min，即得莱菔子炒制品，依次编号为C1～C12。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液

取萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素、芥子酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含萝卜硫苷256.0 μg、芥子碱硫氰酸盐52.1 μg、莱菔素193.0 μg、芥子酸35.7 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液

取莱菔子炒制品粉末（过2号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 mL，密塞，精密称定，超声处理（功率250 W，频率40 Hz）30 min，放冷，再称定质量，以水补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得[10]。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，5%→8%A；15～25 min，8%→20%A；25～40 min，20%→24%A；40～50 min，24%→45%A；50～52 min，45%→5%A；52～55 min，5%→5%A）；流速：1 mL/min；检测波长：225 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.4 特征图谱建立与评价

2.4.1 精密度试验

取同一供试品溶液（S12、C12），按“2.3”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以5号峰（芥子碱硫氰酸盐）为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于2%，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行数据处理，相似度均大于0.995，表明检测系统的精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一供试品（S12、C12）粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，以5号峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于2%，相似度均大于0.990，表明本方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一供试品溶液（S12、C12），按“2.3”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、24 h进样，以5号峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间及相对峰面积RSD均小于2%，相似度均大于0.995，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 特征图谱建立

取不同批次莱菔子生品（S1～S12）和炒制品（C1～C12）粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件依次进样测定，记录色谱图。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），分别以莱菔子生品S1和炒制品C1的图谱为参照图谱，选择多点校正进行匹配，分别生成莱菔子生品和炒制品的特征图谱（见图1）。生品特征图谱匹配出8个共有峰，炒制品特征图谱匹配出11个共有峰。通过与对照品比对，结合DAD紫外光谱，共标定4个色谱峰，分别为1号（萝卜硫苷）、5号（芥子碱硫氰酸盐）、10号（莱菔素）和11号（芥子酸），见图2。

图1 莱菔子HPLC特征图谱

图2 莱菔子生品和炒制品中4种成分HPLC图

2.4.5 相似度评价

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对莱菔子生品和炒制品特征图谱分别进行相似度分析，生品和炒制品特征图谱相似度范围分别为0.959～0.980、0.966～0.996，表明各批次莱菔子样品间所含化学成分基本一致。

2.5 化学计量学分析

2.5.1 系统聚类分析

将莱菔子生品和炒制品特征图谱共13个特征峰峰面积（生品或炒制品中未有峰的峰面积记为0）导入SPSS20.0软件，采用组间均联法，以欧氏距离平方为测度进行HCA，结果见图3。24批特征图谱被聚为2类，生品（S1～S12）为第Ⅰ类，炒制品（C1～C12）为第Ⅱ类，表明所选特征峰可有效区分莱菔子生品和炒制品，也表明莱菔子化学成分在炮制前后有较大变化，差异明显。

图3 莱菔子特征图谱聚类分析

2.5.2 正交偏最小二乘法判别分析

将莱菔子生品和炒制品特征图谱共13个特征峰峰面积作为变量导入SIMCA-P14.1软件，建立OPLS-DA模型。提取2个主成分，模型质量参数R2X＝0.985，预测能力参数Q2＝0.964，均大于0.5，R2与Q2差距＜0.2，表明模型的拟合能力和预测能力良好。设置分类Y矩阵变量随机排列50次做置换检验（见图4），R2和Q2拟合直线在Y坐标轴的截距分别为0.204（Y＜0.3）和-0.785（Y＜0.05），表明所建立的模型可靠，无过度拟合现象，能够判别分析组间差异。经OPLS-DA模型分析分别生成得分图（见图5）和载荷图（见图6）。由得分图可知，数据点均分布在95%置信区间内，炮制前后数据点区分明显，表明莱菔子炮制后化学成分含量发生了较大改变。载荷图显示13个特征峰，在X轴上距离原点越远权重值越大，特征峰1（萝卜硫苷）、9、10（莱菔素）离聚类中心较远，表明这3个峰所代表的化合物含量在炮制前后变化最为显著。变量重要性投影（VIP）结果显示，特征峰1、9、10的VIP值分别为2.6、1.7、1.3，均大于1（见图7），进一步表明这些化合物是莱菔子炮制前后的主要差异标志性成分。

图4 OPLS-DA模型置换检验

图5 莱菔子生品和炒制品特征图谱OPLS-DA得分散点图

图6 莱菔子特征图谱共有峰OPLS-DA载荷散点图

图7 莱菔子特征图谱共有峰VIP图

2.6 含量测定

2.6.1 系统适用性试验

取混合对照品溶液和供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样检测，萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素、芥子酸与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按4个成分峰计算均不低于5000。

2.6.2 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、5、10、20、30 µL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸含量（µg）为横坐标、峰面积积分值为纵坐标，进行回归分析，回归方程及线性范围见表2。

表2 4种成分线性关系考察结果

2.6.3 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10 µL，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积并计算RSD。结果萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸的RSD分别为0.97%、0.78%、0.81%、0.97%，表明仪器精密度较好。

2.6.4 稳定性试验

取同一对照品和供试品溶液（生品S12测定芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸，炒制品C12测定萝卜硫苷），按“2.3”项下色谱条件分别于0、4、8、12、24、48 h进样，测定峰面积并计算RSD。结果对照品中萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸的RSD分别为0.86%、0.89%、0.46%、0.79%，供试品中萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸的RSD分别为1.04%、0.78%、0.91%、1.27%，表明对照品溶液、供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6.5 重复性试验

取同一莱菔子生品和炒制品（生品S12测定芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸，炒制品C12测定萝卜硫苷），按“2.2.2”项下方法分别平行制备6份供试品溶液，进样测定，记录各成分峰面积并计算RSD。结果显示，萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸RSD分别为1.01%、1.26%、1.08%、1.32%，表明本法重复性较好。

2.6.6 加样回收率试验

精密称定已知含量的莱菔子粉末6份（生品S12测定芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸，炒制品C12测定萝卜硫苷），每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入与样品中含量相当的萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算各成分的平均回收率。结果萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸的平均回收率分别为100.14%、99.61%、99.05%、99.52%，RSD%分别为1.94%、2.34%、1.86%、2.17%，表明本法回收率良好。

2.6.7 样品含量测定

取莱菔子生品（S1～S12）和炒制品（C1～C12），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行检测，记录色谱图，外标法计算萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸含量，结果见表3。12批莱菔子生品中萝卜硫苷未检出，芥子碱硫氰酸盐含量为0.21%～0.36%，莱菔素含量为0.80%～1.61%，芥子酸含量为0.02%～0.05%；炒制品中萝卜硫苷含量为2.70%～4.52%，芥子碱硫氰酸盐含量为0.29%～0.52%，莱菔素和芥子酸均未检出。

表3 莱菔子生品和炒制品中4种成分含量测定结果（%，n＝2）

3 讨论

预试验结果表明，莱菔子于130 ℃炒制10 min，炒制品中萝卜硫苷和芥子碱含量最高，“杀酶保苷”效果最好；炒制品形体鼓起，种皮易捻脱，富含油性，具浓郁特殊香气，外观性状辨识度较高。因此，本试验选择130 ℃炒制10 min作为莱菔子炮制工艺。

全波长扫描结果表明，莱菔子水提液在波长225 nm处色谱峰较多，萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸的吸收较强，故选择225 nm作为检测波长。本试验考察了乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸溶液、乙腈- 0.1%磷酸溶液作为流动相及不同洗脱程序对色谱峰峰形和分离效果的影响，最终确定以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱。萝卜硫苷是判断莱菔子炒制是否达到炮制要求的标志性成分，且在水中溶解性较好[11]，因此选择水作为提取溶剂。

本试验比较了不同提取方式（超声、回流）、提取时间（30、45、60 min）和提取次数（1、2、3次）对莱菔子生品和炒制品中萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐、莱菔素和芥子酸提取效果的影响，结果表明超声提取30 min、提取1次为供试品溶液最佳提取条件。

莱菔子特征图谱显示，生品和炒制品具有各自的共有特征峰，可有效评价莱菔子生品和炒制品质量的均一性和稳定性。生品和炒制品特征图谱中均匹配出峰2、5（芥子碱硫氰酸盐）、6、7、12、13，峰10（莱菔素）、11（芥子酸）为生品特有峰，峰1（萝卜硫苷）、3、4、8、9为炒制品特有峰，表明炮制前后莱菔子化学成分变化较大。HCA和OPLS-DA结果表明，匹配出的共有峰可作为莱菔子生品和炒制品的特征峰，所生成的特征图谱可用于判别莱菔子生品与炒制品，且OPLS-DA表明峰1（萝卜硫苷）、9、10（莱菔素）是莱菔子炮制前后主要差异标志性成分。

本试验采用同一色谱条件建立了莱菔子生品及炒制品的特征图谱，结合HCA和OPLS-DA有效区分生品和炒制品，得出炮制前后差异成分；同时测定了莱菔子生品中芥子碱硫氰酸盐、莱菔素、芥子酸和炒制品中萝卜硫苷、芥子碱硫氰酸盐含量。该方法快速、简便、准确，具有定性和定量双重作用，可为有效区分莱菔子生品和炒制品并控制其质量提供依据。