大黄对内毒素性肠损伤大鼠PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响

汪顺，单聪，朱华贺，谭波，李小茜，杨爱东

1.上海中医药大学基础医学院，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203

肠黏膜在防止病原体、毒素和过敏原从外部进入组织起着至关重要的作用。研究表明，脂多糖（LPS）诱导仔猪肠损伤模型中肠黏膜屏障功能被破坏，继而引起促炎因子升高和炎症级联反应，导致肠黏膜损伤加重[1]。因此，改善肠组织损伤是避免炎症反应级联扩大的关键途径。大黄有清热泻火、凉血解毒功效。现代药理研究表明，大黄具有抗炎、抗肿瘤等作用[2]，且可通过抑制炎症因子释放，改善大鼠肠源性脓毒症[3]。mTOR信号通路主要调节机体的生长和代谢，在自噬调节中发挥重要作用[4]。研究发现，激活mTOR信号通路可改善大鼠肠缺血再灌注引起的肠组织损伤[5]。本课题组前期研究表明，大黄可下调mTOR下游p70S6K和eIF4E mRNA的表达从而减少白细胞介素（IL）-6和IL-1β的释放[6]，但是否与mTOR上游PTEN/PI3K/Akt信号通路有关还有待研究。基于此，本实验通过建立LPS诱导大鼠肠组织损伤模型，观察大黄对模型大鼠PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级Wistar雄性大鼠30只，体质量（200±20）g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号SCXY（沪）2018-0006。饲养于上海中医药大学动物中心SPF级动物房。本实验经上海中医药大学动物伦理会审查批准（PZSHUTCM19012502）。

1.2 药物

生大黄27 g，饮片购自上海中医药大学附属曙光医院，批号170401，常规煎制；LPS，来源于大肠杆菌O55：B5，Sigma公司，批号057M4013V；地塞米松片，上海信谊药厂有限公司，批号015190213。

1.3 主要试剂与仪器

PTEN兔抗鼠单克隆抗体（货号9188）、Akt兔抗鼠多克隆抗体（货号4691）、β-actin兔抗鼠单克隆抗体（货号3700），美国CST公司；PI3K兔抗鼠单克隆抗体（货号ab182651），美国Abcam公司；羊抗兔IgG二抗（货号A0208）、RIPA裂解液（货号P0013C）、BCA试剂盒（货号P0010），上海碧云天；EnVision试剂（货号K400311-2），丹麦Dako公司。电热恒温水浴锅（DK-S22），上海精宏；微波炉（WD800SL-4Ⅱ），格兰仕公司；切片机（RM2145），德国徕卡公司；隔水式恒温培养箱（GNP-9270），上海精宏实验设备有限公司；化学发光成像系统，美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模和给药

按随机数字表将大鼠分为正常组、模型组、地塞米松（0.27 mg/kg）组、大黄低剂量（0.8 g/kg）组、大黄高剂量（3.2 g/kg）组，每组6只。适应性喂养1周，造模前地塞米松组、大黄低剂量组、大黄高剂量组给予相应药液灌胃5 d，1次/d。第5日给药后2 h，除正常组外，余各组大鼠尾静脉注射LPS（8 mg/kg）复制肠损伤模型。大黄27 g水煎成84 mL（0.32 g/mL），给药前按4∶1比例稀释成不同剂量，大黄低、高剂量组分别含原药材0.08、0.32 g/mL；取地塞米松片10片，研碎后溶于100 mL纯净水（0.075 mg/mL）。灌胃体积均为2 mL，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。按人与动物间体表面积折算等效剂量[7]。

2.2 取材

大鼠造模7 h后，腹腔注射乌拉坦（2.0 mg/kg）麻醉，75%酒精消毒，打开腹腔，取出大肠组织，经处理后置于4%多聚甲醛中固定，-80 ℃冰箱保存。

2.3 病理观察

取大鼠肠组织，脱水，石蜡包埋，切片（厚度5 μm），常规HE染色，光镜下观察组织病理学变化。

2.4 免疫组化检测肠组织PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达

取大鼠肠组织石蜡切片，常规脱蜡至水，PBS清洗3次×3 min；微波炉加热后自然冷却，清洗3次，0.3%H2O2抑制20 min；清洗3次；依次用20%羊血清、一抗孵育；清洗3次；EnVision试剂（HRP/R）37 ℃孵育30 min；清洗3次；DAB显色；苏木素衬染色，热水蓝化；树脂封片并镜下观察，紫蓝色为背景，棕黄色为阳性产物。采用IMS软件对免疫组化结果进行图像采集并进行半定量分析。

2.5 Western blot检测肠组织PI3K、p-mTOR蛋白表达

称取0.1 g大鼠肠组织，加入1 mL裂解液，4 ℃匀浆，离心后取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白定量，定量后组织原液制备成4 μg/μL蛋白样品，Western blot检测肠组织PI3K、p-mTOR蛋白的表达，采用Image J软件分析灰度值。

3 统计学方法

采用SPSS24.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，符合正态分布两组间比较用成组t检验；偏态分布数据以[M（P25，P75）]表示，2组间比较用Mann-WhitneyU检验；多组间比较符合正态分布且方差齐用方差分析，两两比较用LSD检验；如数据不符合正态分布或方差不齐则用非参数检验方法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 HE染色病理观察结果

正常组大肠组织未见明显病理性改变；模型组肠壁黏膜层广泛变性坏死，大量肉芽组织增生（+++）；各给药组病理学改变较模型组减轻。见图1。

图1 各组大鼠肠组织形态（HE染色）

4.2 免疫组化检测结果

图2 各组大鼠肠组织PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白阳性表达（免疫组化染色，×200）

紫蓝色为背景，棕黄色为阳性产物，肠黏膜上皮细胞呈广泛连续性着色。模型组着色减少，PI3K、Akt着色明显；大黄高剂量组PTEN着色明显增多，各给药组PI3K、Akt着色显著减少；mTOR各组无明显变化。见图2。与正常组比较，模型组大鼠肠组织PTEN蛋白表达显著降低（P＜0.001），PI3K、Akt蛋白表达显著升高（P＜0.001，P＜0.01）；与模型组比较，大黄高剂量组大鼠肠组织PTEN蛋白表达显著升高（P＜0.01），地塞米松组和大黄低、高剂量组大鼠肠组织PI3K蛋白表达显著降低（P＜0.001），Akt蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.001）。结果见表1。

表1 各组大鼠肠组织PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达比较（±s，阳性面积率）

表1 各组大鼠肠组织PTEN、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达比较（±s，阳性面积率）

注：与正常组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

组别 只数 PTEN PI3K Akt mTOR 正常组 6 3.67±0.60 8.65±3.67 6.00（3.87，11.72） 7.00（6.40，12.05） 模型组 6 1.65±0.49*** 13.67±3.22*** 10.69±2.02** 8.08（7.56，10.54） 地塞米松组 6 1.11（0.62，2.51） 9.33±3.70### 7.29（6.05，10.58）# 9.29±6.27 大黄低剂量组 6 1.98±0.51 7.58±1.86### 5.33（4.48，10.18）### 5.19（4.59，11.97） 大黄高剂量组 6 2.38±0.77## 8.08±2.19### 5.74±1.31### 4.91±1.50

4.3 Western blot检测结果

与正常组比较，模型组大鼠肠组织PI3K、p-mTOR蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，地塞米松组和大黄低、高剂量组大鼠肠组织PI3K蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），地塞米松组和大黄低、高剂量组大鼠肠组织p-mTOR蛋白表达显著降低（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。结果见图3。

图3 各组大鼠肠组织PI3K、p-mTOR蛋白表达比较（±s，每组6只）

5 讨论

LPS作为内毒素的主要成分，是一种强力的炎症诱导剂[8]。肠道被认为是导致多种严重疾病的始动器官[9]，肠道中存在大量革兰阴性菌[10]，是内毒素的潜在来源，当机体处于休克、感染等应激状态时，内毒素会透过肠黏膜进入血液，导致内毒素血症、脓毒症及多器官功能障碍综合征等危重症疾病[11-12]。由此可见，改善肠组织损伤，恢复肠黏膜的“屏障”功能是避免由内毒素引起的全身炎症反应和危重疾病的关键一环。

PI3K/Akt信号通路与LPS引起肠黏膜屏障功能密切相关[13-14]。PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，在细胞的生长、迁移和细胞周期进程中有着重要作用[15]，影响细胞多种生物学功能。PI3K通常可被生长因子、细胞因子和激素等细胞外刺激所激活，激活后的PI3K磷酸化下游靶标并激活Akt[16]。活化的Akt可磷酸化哺乳动物mTOR，并发挥自噬调节作用[17]。PTEN参与细胞生长、代谢，以及细胞结构与环境有关的多个细胞过程[18]，其最重要的功能是使PI3K下游靶标去磷酸化并抑制Akt的激活，是PI3K/Akt信号传导的主要负调节剂[19]。

本研究发现，模型组大鼠肠壁黏膜层广泛变性坏死，大量肉芽组织增生，提示造模成功。大黄低、高剂量组病理学改变较模型组减轻，表明大黄对LPS导致的肠组织损伤具有保护作用。本实验结果显示，模型组大鼠肠组织PTEN蛋白表达显著降低，PI3K、Akt、p-mTOR蛋白表达显著升高，表明LPS引起的肠组织损伤与PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。

Kwon等[20]研究发现，大黄可通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1抗氧化剂途径，阻断核因子-κB失活导致的促炎因子和介质的释放，从而减轻食管黏膜炎症损伤。彭淑梅等[21]研究发现，大黄可降低肿瘤坏死因子-α水平，改善全身性炎症反应综合征。本实验结果表明，大黄能改善内毒素导致的大鼠肠损伤，且能上调PTEN，下调PI3K、Akt、p-mTOR蛋白的表达。虽然免疫组化结果显示各组大鼠肠组织mTOR蛋白表达无显著差异，但Western blot结果显示模型组大鼠肠组织p-mTOR表达显著升高，大黄低、高剂量组p-mTOR显著降低，表明LPS能磷酸化mTOR，而大黄对此产生抑制，这可能与大黄降低其上游蛋白Akt的表达有关。

PTEN/PI3K/Akt信号通路是细胞内参与增殖调控的信号通路之一，与自噬高度相关[22]。研究表明，Akt磷酸化后mTOR会形成mTORC1，mTORC1能磷酸化多种自噬相关蛋白并抑制自噬体的形成，从而抑制自噬作用[23-24]。此外，结节性硬化复合物1和2（TSC1/2）可将有活性的GTP酶转化成无活性的GDP并负性调控mTORC1[25]。我们前期研究表明， 大黄可下调mTOR下游p70S6K和eIF4E mRNA的表达，但并未验证其上游其他蛋白或基因的表达。本研究发现，大黄可降低模型大鼠肠组织p-mTOR表达，除与上游Akt表达降低有关外，可能还与TSC1/2复合物有关，我们将在以后的实验中深入研究。

综上，大黄对内毒素性肠损伤大鼠具有保护作用，其作用机制可能与其上调PTEN和下调PI3K、Akt、p-mTOR蛋白表达有关。