五指毛桃转录组及黄酮类化合物生物合成关键基因分析

陈荣珠　李珍　林美珍　王小平　赖钟雄

摘  要：五指毛桃含有香豆素類、黄酮类等化学成分，具有抗炎、抑菌、抗病毒和肿瘤的药用价值。但是，其转录组和功能基因组等分子水平的研究较少报道。本研究首次采用RNA-seq高通量测序技术对五指毛桃的根、茎和叶进行转录组测序，共获得104 335条unigenes，平均长度为578 bp，有62 142条unigenes被注释到Nr、GO、Swiss-Prot、KEGG和KOG等数据库中，根据同源序列比对发现五指毛桃与川桑的同源性最高。通过比较五指毛桃不同组织部位的转录组测序结果，发现Leaf_vs_Root、Root_vs_Stem、Stem_vs_Leaf分别有1363、624和1006个差异表达的基因在KEGG途径显著富集，主要富集在植物信号转导、植物MAPK信号通路、黄酮类生物合成等代谢途径。进一步分析参与植物黄酮类生物合成途径中的差异表达基因，发现有16个差异表达的基因参与该代谢途径，主要在叶和茎中高表达，运用RT-qPCR对黄酮类化合物生物合成途径中9个关键基因的表达量进行验证，发现定量结果与RNA-seq数据一致，大部分基因都在五指毛桃茎和叶片中高表达，因此五指毛桃幼苗黄酮类化合物主要积累在叶片和茎中，这与民间主要以根茎作为药用部位存在差异，主要原因可能是与五指毛桃生长年龄有关。以上的研究结果为五指毛桃分子生物学的研究奠定基础，并为其活性成分的生物合成调控、栽培技术等提供参考依据。

关键词：五指毛桃;RNA-seq;黄酮;生物合成;实时荧光定量PCR

中图分类号：S567.1      文献标识码：A

Transcriptome Analysis of Ficus hirta Vahl and Expression Profiling of Key Genes Involved in Flavonoid Biosynthesis

CHEN Rongzhu1， LI Zhen1， LIN Meizhen1， WANG Xiaoping1*， LAI Zhongxiong2*

1. Department of Pharmacy， Zhangzhou Health Vocational College， Zhangzhou， Fujian 363000， China; 2. Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Ficus hirta Vahl contains coumarins， flavonoids and other chemical components， which have anti-inflammatory， bacteriostatic， antiviral and tumor medicinal value. However， the molecular research such as transcriptome and functional genome have less studied. Transcriptome sequencing was performed for the first time on different tissues of F. hirta Vahl using the RNA-seq high-throughput sequencing technique， and the result showed that a total of 10 4335 unigenes were obtained and 62 142 unigenes were annotated to the database of Nr， GO， Swiss-Prot， KEGG and KOG et al. F. hirta Vahl had the highest homology with Morus notabilis， according to the homologous sequence alignment. Comparative transcriptome analysis of different tissues of F. hirta Vahl showed that a total of 1363， 624 and 1006 genes were differentially expressed in the pairwise comparisons of Leaf_vs_Root， Root_vs_Stem and Stem_vs_Leaf， respectively. Among them， plant signal transduction， MAPK signal pathway-plant， and flavonoid biosynthesis related genes were significantly enriched， especially flavonoid biosynthesis pathway. Further analysis of differentially expressed genes involved in flavonoid biosynthesis showed that there were 16 differentially expressed genes involved in the pathway， which were mainly highly expressed in leaves and stems. The expression levels of key genes involved in flavonoid biosynthesis were verified by RT-qPCR， and the results were consistent with those of transcriptome sequencing. Therefore， flavonoids were mainly accumulated in the leaves and stems from young F. hirta Vahl. The above research results could lay a foundation for the research of molecular biology of F. hirta Vahl， and provide reference for the active component biosynthesis regulation and cultivation techniques.

Keywords： Ficus hirta Vahl; transcriptome high-throughput sequencing; flavonoid; biosynthesis; RT-qPCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.008

五指毛桃为桑科榕属植物粗叶榕（Ficus hirta Vahl），其掌状叶形如五根手指，果实状如毛桃，因此被称为五指毛桃，又因其根皮具有牛奶的清香，所以又有“五指牛奶”的美称，有文献报道同属植物极简榕（Ficus simplissima Lour.）的干燥根也作为五指毛桃，是岭南地区习用中草药[1]。五指毛桃为地道的民族用药，广东、广西、福建、湖南、云南等省（区）14个少数民族均有用药记载，目前产区主要为广西、广东等地，以野生供应市场需求，其用药部位为根茎。中医认为，五指毛桃性平、味甘、辛，对脾虚浮肿、肺痨咳嗽、食少无力、风湿痹痛、盗汗、产后无乳等症有很好的疗效[2]。目前已从五指毛桃中鉴定出多种化学成分，如香豆素类、黄酮类、甾醇类等[3-5]，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用[6-7]，同时还能提高机体的免疫能力[8-9];通过对其挥发油类化合物进行测定，发现十六酸、油酸、亚油酸等为其主要含有的挥发油类成分[10]。黄酮类化合物是一种重要的天然有机化合物，具有抗氧化、抗癌症、抗肿瘤以及提高机体免疫机能等方面的功效，其为五指毛桃活性物质中数量最多的一类，如芹菜素、橙皮苷、甲氧基黄酮[11-12]、牡荆苷[13]、柚皮素[3]、槲皮素、金合欢素[4]等，具有较高的研究和药用价值。

随着高通量转录组测序技术的发展，不仅在模式植物及重要的农作物上具有普遍的运用，近几年也在药用植物上得到了广泛的运用[14]。该技术可在缺少参考基因组情况下全面分析某一物种的转录水平，从而确定转录本及其核酸序列，为理解物种的生物学及生物化学等方面提供技术手段[15]。目前，国内外在西洋参[16]、甘草[17]、丹参[18]、金线莲[19]、半枝莲[20]、穿心莲[21]等药用植物开展转录组研究，从中挖掘和分离出了大量与次生代谢产物相关的基因。目前，关于五指毛桃的研究主要集中在生物学特征、活性成分的测定、药理作用及栽培种植等方面，然而，五指毛桃的转录组和功能基因组等分子水平上的研究较少报道。本研究利用Illumina HiSeq X Ten测序平台对五指毛桃的根、茎和叶进行了大规模的转录组学分析，阐述了五指毛桃不同组织部位的生物学过程和代谢调节相关途径及基因表达的变化，重点分析了黄酮类化合物生物合成途径中关键基因的表达特性，以期为五指毛桃活性成分的生物合成與调控等分子机制的研究及次生代谢工程的发展提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

野外采集五指毛桃种子，植株特征为：灌木，嫩枝中空，小枝、叶、果实均被金黄色长硬毛，有乳汁。叶片通常掌状分裂;瘦果椭圆形。植株经漳州卫生职业学院李珍讲师鉴定为粗叶榕（Ficus hirta Vahl）。种子委托广西新众农业有限公司育苗，得到2月龄五指毛桃小苗。将植株的根、茎、叶分开采集后迅速置于液氮中冻存，然后保存于?80 ℃冰箱用于后续转录组测序及相关试验。

1.2  方法

1.2.1  RNA提取  采用Trizol（Invitrogen， CA， USA）试剂盒进行样品总RNA的提取，并用DNase I（Takara Bio， Japan）消化基因组中的DNA。总RNA的浓度和质量分别用安捷伦2100型（Agilent Technologies， USA）生物分析仪测定，并用琼脂糖凝胶电泳评估总RNA的完整性。选取质量、浓度和完整性符合要求的总RNA用于后续cDNA文库的构建。

1.2.2  cDNA文库的构建和高通量测序  首先将带有Oligo dT（Qiagen， China）磁珠与mRNA完全结合，纯化mRNA，然后加入打断剂（Frag/Rrime buffer），用移液枪反复吸打混匀后置于PCR仪中进行mRNA片段化。以该片段为模板，用随机六聚体引物和SuperScript III（Qiagen， China）逆转录酶进行第一链cDNA的合成，然后以第一链cDNA为模板，RNase H和DNA聚合酶I（Qiagen， China）进行第二链cDNA的合成。用QIAquick PCR提取试剂盒（Qiagen， China）将双链cDNA纯化及末端修复/dA尾添加，接着用T4连接酶进行接头连接，然后将连接产物纯化、片段大小分选和文库扩增。用凝胶电泳、安捷伦2100型（Agilent Technologies， USA）生物分析仪和定量PCR仪（T100? Thermal Cycler， BIO-RAD）检测所构建的文库质量，最后，用Illumina HiSeq X Ten测序平台对合格的文库进行RNA-seq，以获得原始数据（Raw reads），该高通量测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.3  质量控制与De novo组装  将测序获得的原始数据（Raw reads）进行质量控制，去除接头序列、低质碱基（Q值<20）、含量超过10%的N碱基的序列，获得高质量的Clean reads。使用Trinity程序将Clean数据De novo组装成转录本，对拼接获得的转录本去除冗余，取每个转录本聚类最长的转录本作为unigene，用于后续的分析。

1.2.4  Unigene功能注释  将获得的unigene用NCBI Blastx后比对到蛋白质数据库Nr、KOG、Swiss-Prot、TrEMBL、CDD、PFAM和KEGG（E-value≤0.00001），获得与序列相似度最高的蛋白质进行五指毛桃unigene的功能注释。用topGO进行GO注释和分类[22]，并将unigene用NCBI Blastx后与NR数据库进行比对，获得与五指毛桃相近的物种以及同源序列的功能信息。

1.2.5  差异表达基因的筛选和GO和KEGG富集分析  利用RSEM（RNA-seq by Expectation Maximization）法计算基因的表达量，并用TPM

（Transcripts Per Million）方法对相关基因表达水平进行归一化处理。再采用DEseq进行差异分析，并对统计得到P值进行FDR矫正获得q值，为了得到显著差异的基因，将筛选条件设为q<0.005且差异倍数|FoldChange|>2。分别使用topGO（http：//www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/topGO.html）和clusterProfiler（http：//www. bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clus?te?r-Profiler.html）進行差异表达基因的GO和KEGG富集分析，且认为P<0.05为显著富集。

1.2.6  五指毛桃unigene SSR和SNP/InDel分析  使用MISA（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/ misa/）对五指毛桃根、茎和叶基因转录本进行SSR检测，找出SSR标记之后，使用Primer3完成SSR引物设计，参数均设为默认。使用BCFtools（http：//www.htslib.org/doc/bcftools.html）进行SNP/InDel calling，抽提各样本中的SNP/InDel。并对其进行质量值大于20、覆盖度大于8的过滤。

1.2.7  黄酮类化合物生物合成关键基因的RT- qPCR验证  为了进行黄酮类化合物生物合成关键基因的RT-qPCR验证，从五指毛桃根、茎、叶的每个样品中提取总RNA 500 ng，利用SYBR Ex Script?试剂盒（TaKaRa， China），用随机引物和Oligo dT引物逆转录成cDNA。RT-qPCR引物参照引物设计原则，利用DNAMAN 6.0软件进行设计（表1），引物送北京六合华大科技有限公司合成。RT-qPCR操作方法按照试剂盒（TaKaRa， China）操作说明进行，参照同属植物桑树的相关研究以ACT3为内参基因[23]，通过罗氏Light Cyclers荧光定量PCR仪进行，采用RT-qPCR检测9个关键基因的相对表达量，并用2?ΔΔCT法进行计算，利用Graphpad Prism软件作图。

2  结果与分析

2.1  转录组测序质量分析和De novo组装

利用RNA-seq技术对五指毛桃的根、茎、叶进行转录组测序，共生成138 712 412个高质量reads，Q20碱基百分比（测序错误率小于1%）分布介于98.58%～98.63%之间，Q30碱基百分比分布（测序错误率小于0.1%）介于94.92%～95.05%之间，GC碱基含量介于47.89%～49.17%之间（表2）。质量评估结果表明五指毛桃的转录组测序数据质量较高，可用于后续分析。使用Trinity将高质量数据进行De novo组装成转录本，重新组装成104 335条unigenes，平均长度为578 bp，其中N50长度为1025 bp，unigene序列长度分布见图1，这些获得的转录本可作为五指毛桃参考的转录本。

2.2  五指毛桃unigene的注释分析

将获得的unigene用NCBI Blastx后比对到蛋白质数据库CDD、KOG、Nr、Swiss-Prot和KEGG等9个数据库，根据比对蛋白数据库的序列同源性结果可知（表3），至少在1个数据库注释成功的unigene有62142条，占59.56%，其中与GO数据库匹配的unigene数目最多为51552条，占总数的49.41%;其次为Swiss-Prot数据库（49 172个），占47.13%;在所比对数据库中都有注释的unigene数目为2397条，占2.21%。为了研究五指毛桃转录本序列与相近物种的近似情况和同源序列的功能信息，将序列与Nr数据库进行比对，分析unigene数据的物种分布，得到各序列之间的最佳匹配结果如图2所示。不同物种在不同水平上与五指毛桃unigene序列存在相似，其中与川桑（Morus notabilis）表现出明显的相似性，达到16.23%;其次是小麦（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）和枣（Ziziphus jujuba），相似性分别为2.67%和2.44%，与软克里藻（Klebsormidium flaccidum）和胶球藻C-169（Coccomyxa subellipsoidea C-169）相似性分别为1.53%和0.93%。

对五指毛桃转录本的潜在功能进行预测和分类，将所有转录本与KOG数据库进行比对。结果如图3所示，35661条转录本被分成26个KOG群，其中翻译-核糖体结构和生物发生基因数目最多，为4840个，占4.64%;其次是翻译后修饰-蛋白质转换-分子伴侣为3669个，占3.52%;一般功能预测类有3633个，占3.48%;信号转导机制有3428个，占3.29%。同时，有1262个（1.21%）转录本参与次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢。

基于GO分析，对所有unigene的潜在功能进行分类，如图4所示，共获得404727条GO注释信息，其中，在生物过程中，可将五指毛桃unigene分成26类，参与细胞过程的数量最多，为34056个，其次是代谢过程为30357个;在分子功能方面，五指毛桃的unigene被分成19类，参与结合和剪切活性的个数远远多于其他，分别为29343和27867个;在细胞组分上，五指毛桃的unigene可被分成22类，参与细胞的数目最多，为38314个。

利用KEGG数据库预测分析五指毛桃unigene可能参与的生物化学途径，结果如图5所示。总共有7744条unigene被注释到285个KEGG途径中，又可细分为细胞过程、环境信息处理、基因信息处理、代谢、生物系统，其中运输和分解代谢（289个）、信号转导（501个）、翻译（799个）、碳水化合物代谢（436个）、内分泌系统（187个）是每个分类中参与基因个数最多的。

2.3  五指毛桃根、茎、叶差异表达基因的分析

通过筛选，共获得27382个差异表达的基因，占总基因数的26.24%。用DESeq法对五指毛桃根、茎、叶3个样品进行两两比较，发现Leaf_vs_Root之间差异表达的基因个数最多为11755个，9550个基因上调表达，2205个基因下调表达;而Root_vs_Stem之间差异表达基因数目最少为5559个（图6）。

将差异表达的基因进行KEGG富集分析，结果发现在Leaf_vs_Root、Root_vs_Stem、Stem_vs_ Leaf分别有1363、624和1006个差异表达的基因在KEGG途径中显著富集，其中Leaf_vs_Root相比富集差异表达的基因个数较多的是核糖体（135个）、碳代谢（81个）、植物激素信号转导（56个）;Root_vs_Stem相比，核糖体（73个）、碳代谢（36个）是富集差异表达基因个数较多的通路;Stem_vs_Leaf相比，富集差异表达基因个数较多的是碳代谢（60个）、植物激素信号转导（53个）、淀粉和蔗糖代谢（40个）。分析各组分间具有显著差异的通路，发现Leaf_vs_Root、Root_vs_Stem、Stem_vs_Leaf分别有21、21和22条具有显著富集的通路，其中植物信号转导（plant hormone signal transduction）、植物MAPK信号通路（MAPK signaling pathway-plant）、黄酮类生物合成（flavonoid biosynthesis）为3组两两比较均共有显著富集的通路，而黄酮类生物合成代谢通路中差异基因的改变最为明显。

黄酮类生物合成通路是直接与次生代谢产物黄酮类化合物具有直接关系，分析后共获得与该代谢通路中相关基因个数为16个基因显著性差异表达，涉及到10种酶，分别为二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase， DFR）、查尔酮合成酶（chalcone synthase， CHS）、反式肉桂酸4-单加氧酶（trans-cinnamate 4-monoox?ygenase， C4H）、查尔酮/查尔酮-黄烷酮异构酶（chalcone isomerase、Chalcone-flavanone isomerase， CHI）、莽草酸羟基肉桂酰转移酶（shikimate hydroxycinnamoyltransferase， HST）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（caffeoyl-CoA O-methyltrans?ferase， CCOMT）、黄酮类3-单加氧酶（flavonoid 3-monooxygenase， F3H）、百花色素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase， LDOX）、乙醇乙酰基转移酶（alcohol acetyltransferase， AAT）、细胞色素P450（cytochrome P450 family protein， CYP），各类酶对应基因在五指毛桃根、茎、叶中的TPM值及相关详细信息见表4。通过对这些参与黄酮类生物合成途径中相关基因在五指毛桃根、茎、叶的TPM值的分析可知，8个基因在叶片中有最高的TPM值，7个基因在茎中有最高的TPM值，只有1个基因在根中有最高的TPM值。

2.4  五指毛桃根、茎、叶基因转录本的SSR和SNP/InDel分析

通过五指毛桃根、茎、叶的基因转录本进行SSR分析，结果表明共有26 520条unigene有SSR位點分布。单碱基重复和双碱基重复是SSR的主要类型（图7），分别占50.29%和31.46%，A/T和AT/AG分别为单核苷酸和二核苷酸的主要重复类型。

通过五指毛桃根、茎、叶的基因转录本SNP/InDel分析发现，其根、茎叶基因转录本SNP分别为47 051、60 922和70 272个，发生InDel事件分别为8665、10 046和10 123个，其中SNP的主要类型为C->T/G->A/A->G转换（图7）。

2.5  五指毛桃黄酮类化合物生物合成关键基因RT-qPCR分析

对黄酮类化合物生物合成中9个关键基因进行RT-qPCR，以根为参照样品，茎和叶中各基因的相对表达量见图8。这9个关键基因在根、茎

和叶中的相对表达量与RNA-seq数据中TPM值的变化趋势基本一致，其中DFR、CHS、CHI、F3'H和AAT在五指毛桃的叶中有最高的相对表达量，C4H、HST和LDOX在茎中有最高的相对表达量，而CCOMT在根中有最高的相对表达量。

3  讨论

本研究首次利用高通量测序技术对五指毛桃的根、茎和叶进行转录组测序，总共获得104335条unigenes，这些unigenes平均长度为578 bp，N50平均长度为1025 bp，Q20、Q30碱基百分比均大于94%，在GO、Siss-Prot、TrEMBL、Nr等4个数据库中均有大量unigenes被注释，说明本次转录组测序数据质量高，为五指毛桃有效成分生物合成及育种等相关研究提供理论基础。

黄酮类化合物是植物体内一类重要的次生代谢产物，大多与糖类结合形成糖苷。黄酮类具有多种多样的生物学功能，能调节果实风味、改变花果色泽等，还可作为一种重要的抗逆性物质，能够提高植物抗性[24-26]。同时，黄酮类化合物对人体健康还具有重要的生理功能，其可清除人体自由基，在抑菌、降血脂、消炎、抗病毒、抗癌等方面具有重要的作用[27-28]。药用植物黄酮类化合物含量与其种植环境和种植时间均具有密切的关系，对金线莲根、茎、叶中黄酮含量进行测定，发现叶的总黄酮含量占全草的总黄酮含量80%以上，而茎和根约各占不到10%，对组织培养、种植1个月和种植4个月的金线莲新鲜叶片的黄酮含量进行测定，发现黄酮类成分含量随着种植时间的延长而增加，并对黄酮类生物合成通路中的6个关键基因进行RT-qPCR验证，发现6个基因的相对表达量在种植4个月的金线莲叶片中最高[19];不同光质对植物中黄酮类化合物含量也有影响，蓝光能够促进大豆芽苗菜、青钱柳叶（Cyclocarya paliurus）中黄酮的合成[29-30]。

CHS是黄酮类化合物合成途径中的第1个关键酶，在该酶的作用下形成查尔酮，查尔酮能够通过进一步衍生形成各类黄酮类化合物[31]，研究表明CHS的表达与否直接与植物黄酮类化合物含量多少有关[32]。CHI是黄酮类化合物代谢途径中的第2个关键酶，该酶是植物中查尔酮转化成黄烷酮必须的酶[33];刘长英等[34]克隆获得了桑树（Morus alba L.）查耳酮异构酶基因（MaCHI）全长序列，采用RT-qPCR法分析MaCHI在不同组织中的表达水平，发现该基因在叶片和果中的表达量较高，在根中表达量较低。F3H属于细胞色素P450类，是黄酮类化合物代谢途径上的关键酶，能调控黄酮类化合物合成途径中的代谢流向，它催化生成二氢黄酮醇，而二氢黄酮醇是黄酮类化合物生物合成中生成黄酮、花色素和异黄酮等黄酮类化合物的重要中间产物[35]。二氢黄酮醇4-还原酶DFR是黄酮类生物合成途径中的下游关键酶，它能催化黄烷酮醇形成无色花色素，是花青素合成途径中的关键酶，无色花色素可作为花青素和缩合单宁的前体物质[32]。LDOX是一种2-酮戊二酸依赖性酶，通过抑制LDOX基因发现石竹目中花青素含量较少[36]。通过RNA-seq数据和RT-qPCR结果可知，黄酮类化合物合成途径中关键基因主要在五指毛桃叶和茎中高表达，因此，这几个基因的表达情况与黄酮类化合物的含有具有直接的关系。

本研究以2月龄的五指毛桃根、茎、叶为材料进行转录组测序，3个样品两两比较后发现存在大量差异表达的基因，对差异表达基因进行KEGG通路富集分析，结果发现主要涉及植物信号转导、植物MAPK信号通路、黄酮类生物合成这3条通路。对黄酮类生物合成通路中大部分关键酶基因的TPM值进行分析，发现大部分基因在叶片和茎中高表达，而仅有1个基因在根中高表达，同时，对其中9个关键基因进行RT-qPCR验证，发现这9个基因在五指毛桃根、茎和叶中的相对表达量变化趋势与RNA-seq数据一致，大部分基因都在茎和叶中高表达，因此，我们推测幼苗五指毛桃的黄酮类化合物主要积累在茎和叶片中，这与民间习惯用药部位根茎具有一定的差異，可能原因是本次转录组所用的材料为幼苗，而民间药用一般为种植多年的植株。五指毛桃根、茎和叶中黄酮类等次生代谢产物随着种植时间的延长，由叶片往根茎运输，并在根中大量积累，该研究成果为扩大用药资源具有重要的意义。因此，黄酮类生物合成的关键基因在植物生长过程中具有复杂的调控作用，其网络调控有待于进一步的研究。

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责任编辑：崔丽虹

收稿日期  2020-04-22;修回日期  2020-05-29

基金项目  漳州卫生职业学院院本课题（No. ZWYZ201801）;漳州市科技局科技重大专项（No. ZZ2018ZD2019）;福建高等学校新世纪优秀人才支持计划（闽教科[2017]52号）。

作者简介  陈荣珠（1986—），女，博士，讲师，研究方向：植物生物技术。*通信作者（Corresponding author）：王小平（WANG Xiaoping），E-mail：84004279@qq.com;赖钟雄（LAI Zhongxiong），E-mail：laizx01@163.com。