基于网络药理学探讨附子治疗慢性心力衰竭的机制

童晶晶，黎 军，周裕文，黄雪娟

（南方医科大学顺德医院附属陈村医院，广东 佛山 528000）

慢性心力衰竭是由各种原因引起心脏结构重构异常，导致心脏功能不全的一种临床综合征，是大多数心血管疾病进展的晚期阶段。成人慢性心力衰竭的患病率高达0.9%，且该数字可随着人群年龄的增长而增加[1]。目前，临床上仍以利尿剂、强心药、血管扩张药及血管紧张素转化酶抑制剂等西药为主对慢性心力衰竭患者进行治疗，但这类药物仅可控制其症状，无法延缓其病情的进展及根治其病情[2]。近年来，中医药在慢性心力衰竭的治疗中取得较大的进展。中医药具有长效、副作用少等特点，不仅注重改善患者的临床症状，而且注重调理其体质，提高其生活质量。慢性心力衰竭的症状与中医“心水”的临床表现相似。不少医家认为，中医辨证心水以阳虚立论[3]。附子是补火助阳的经典中药。名老中医李可方基于心力衰竭以阳虚为本这一理论，重用附子治疗慢性心力衰竭，取得显著的疗效。这说明，用附子治疗慢性心力衰竭具有广阔的应用前景。不过，用附子治疗慢性心力衰竭时，该药物的活性成分及作用靶点尚待相关研究人员进行进一步的探讨。本研究利用网络药理学构建了附子- 慢性心力衰竭- 靶点，为进一步探讨附子治疗心力衰竭的机制奠定了基础。

1 方法

1.1 建立附子的信息数据集

BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）是国内科学家开发的首个探讨中药分子机制的在线分析工具。BATMAN-TCM 的主要功能包括中药组成成分的靶标预测和潜在靶标的功能分析，还可进行成分-靶标-通路/ 疾病关联网络的可视化分析。利用BATMAN-TCM 建立附子信息数据集，在BATMAN-TCM 的搜索框内输入“附子”，将检索条件设置为系统默认值（即调整后的P 值≤0.05，Score cutoff ≥20），即可得出附子的活性成分- 靶标信息数据集。

1.2 建立慢性心力衰竭的生物信息数据集

CTD（http://ctdbase.org/）可用于选择与慢性心力衰竭相关的靶标。CTD 是一个开放式数据库，可提供不同类型分子的集中式集成数据及来自各种生物的毒理学数据。CTD整合了有关化学基因、蛋白质相互作用、化学疾病和基因疾病相互作用的信息。在CTD 搜索框内输入 “心力衰竭”、“慢性心力衰竭”、“充血性心力衰竭”及“心肌衰竭”等关键词，以获得与慢性心力衰竭相关的靶标。

1.3 获取附子-慢性心力衰竭- 基因数据集的蛋白互作网络（PPI）

Draw Venn Diagram 在线工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/Venn/）可用于分析慢性心力衰竭和附子的交叉基因集，构建附子- 慢性心力衰竭- 基因数据集。将构建的数据集输入String 数据库（https://string-db.org/）。STRING 数据库是一个可预测蛋白质的直接和间接相互作用、建立蛋白质之间网络的数据库，拥有来自2031种生物的9 443 763 个蛋白质。选择综合得分（Combined score）＞0.4 分的蛋白质构建PPI[4]。

1.4 用基因本体论（Geneontology，GO）分析附子-慢性心力衰竭- 基因的生物学过程

GO 是在生物学领域应用广泛的进行基因功能分类和基因产物功能描述的系统。 Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一种高效且直观的基因富集分析在线工具，具有集成发现和注释的功能，专注于对基因功能和GO 术语的解释。将慢性心力衰竭和附子的交叉基因集输入Metascape，对其进行GO 分析[5]。

1.5 用京都基因与基因组百科全书（KEGG）探讨附子-慢性心力衰竭-基因的生物学通路

KEGG 是一个基因功能系统分析知识库。该数据库将基因组信息与高阶功能信息联系起来，从而获得丰富的生物学途径。将慢性心力衰竭和附子的交叉基因集输入Funrich 插件，确定其KEGG 途径，筛选标准为P ≤0.05。

2 结果

2.1 附子的生物信息集

在用BATMAN-TCM 进行检索与筛选后，共获得85个附子的化合物，其中有27 个化合物因无明确的化学结构而被剔除，最终纳入58 个化合物，包括Talatisamine、Benzoylaconine、Aconitine、Delphin、Delgrandine、Aconine、14-Deoxy-11、12-Didehydroandrographolide、Delbruline、Deltaline、Delavaconitine、Deltamine、Uracil、Carmichaeline、Delsoline、Delcorine、Karanjin、Salsolinol、Crassicauline A、2,7-Dideacetyl-2,7-Dibenzoyl-Taxayunnanine F、Delphamine、Bullatine B、Benzoylhypaconine、Bullatine C、Coryneine、Vilmorrianine C、3-Acetylaconitine、Deoxyaconitine、Denudatine、Delsemine B、Delphatine、Delsemine A、Demethyldelavaine A、M-Aminophenol、Karakoline、Hypaconitine、Talatizamine 等（见图1）。附子所对应的靶点共有253 个，包括ABCB1、ABCC9、ACE、ACHE、ADIRF、ADORA2A、ADORA2B、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A 等（见图1）。

图1 附子-化合物-基因相互作用网络

2.2 慢性心力衰竭的生物信息集

通过CTD 数据库获得与慢性心力衰竭相关的生物信息集，共筛选出113 个与慢性心力衰竭有关的基因。将这113个基因导入Cytoscape 3.7.1 中进行可视化。与慢性心力衰竭相关的靶标包括ACAA1B、ACACA、ACADS、ACE、ACLY、ADIPOQ、ADRA2C、ADRB1、ADRB3、AGT、AGTR1、ALB 及ALDH1A7（见图2）。

2.3 附子-慢性心力衰竭- 基因数据集的PPI

将附子的总靶点列表与慢性心力衰竭的相关基因靶点列表导入VENN 后，得出与附子- 慢性心力衰竭相互交联的基因有17 个重叠靶标，包括ACE、NR3C2、NPPA、ADRA2C、ADRB1、TNF、HTR2B、ADRB3、PTGS2、IL-1β、AGTR1、IFNG、ALB、PTGS1、NRG1、CRP、IL6。 这17个重叠靶标代表了附子治疗慢性心力衰竭的核心机制和潜在目标（见图3）。

图2 慢性心力衰竭的基因靶点集

图3 附子-慢性心力衰竭-基因的PPI 图

2.4 附子- 慢性心力衰竭- 基因的生物学过程

慢性心力衰竭和附子重叠靶标的生物学功能显著富集于调节血管收缩、调控炎症反应、调节血压水平及脂肪的分解中，并可维持多细胞生物体内的平衡，参与钙介导的信号传导和内分泌过程、干细胞分化，同时参与受体介导的内吞作用、髓样白细胞介导的免疫反应等（见图4）。

图4 附子-慢性心力衰竭-基因的生物学过程

2.5 附子- 慢性心力衰竭- 基因的生物学通路

通过对附子-慢性心力衰竭的交叉基因进行Funrich 分析后发现，二者的重叠靶点共参与了4 条途径，包括IL-27信号通路途径、IL-23 信号通路途径、调控肾上腺皮质激素受体途经、调控生物胺结合受体途经（见图5）。

图5 附子-慢性心力衰竭-基因的生物学通路

3 讨论

根据中医辨证论治的原则，慢性心力衰竭属于“心水”的范畴。该病以心气心阳虚为本，以血瘀、水停、痰饮为标，治当益气温阳、活血利水。附子味辛、性大热，是回阳救逆的有效药物之一，广泛用于慢性心力衰竭或心肌梗死的治疗[6]。但目前临床上尚未系统地阐明附子治疗慢性心力衰竭的物质基础和靶点[7]。本文拟构建附子-慢性心力衰竭-靶点网络，从而系统地分析附子治疗慢性心力衰竭的作用机制。

与附子- 慢性心力衰竭相互交联的基因有17 个靶点，分别为ACE、NR3C2、NPPA、ADRA2C、ADRB1、TNF、HTR2B、ADRB3、PTGS2、IL-1β、AGTR1、IFNG、ALB、PTGS1、NRG1、CRP、IL-6。附子- 慢性心力衰竭- 基因数据集的功能包括类固醇激素受体激活、心率调节和血压调节。这些功能还与心肌细胞代谢、心电图活动、血液灌注、炎症反应及氧化应激反应有关。此外，附子- 慢性心力衰竭- 基因数据集具有相似的生物学过程和多靶标协同的特性。例如，CRP、IL-1β 及IL-6 水平的升高可诱导心肌细胞的凋亡，降低心室壁的顺应性，并可引起冠状动脉微血管内皮的炎症反应。靶向CRP、IL-6 和IL-1β 具有减轻心脏循环系统炎症反应的作用，并可改善心室的适应性[8]。肾素- 血管紧张素系统具有调节血管收缩、维持内环境稳定的作用。在慢性心力衰竭的状态下，肾素-血管紧张素系统被激活，参与心脏前后负荷的形成，故治疗指南中明确指出，血管紧张素转化酶抑制剂是治疗慢性心力衰竭的基本药物，靶向血管紧张素转化酶是治疗该病的一个重要靶标，而ACE、AGTR1 参与调节肾素-血管紧张素系统[9-10]。NR3C2 的激活与过度炎症反应、纤维化及靶器官损伤的发生均具有密切的关系。NPPA 是心力衰竭的敏感标志物。慢性心力衰竭患者的病情严重时，其NPPA 的水平可明显上升。通过抑制NR3C2 的表达，可减轻心肌间质纤维化的程度[11-12]。研究表明，使用可抑制PTGS1 和PTGS2 活性的非甾体抗炎药可增加慢性心力衰竭的发病风险。其原因为，这两种酶类可减少具有心脏保护作用的前列腺素E 的产生。ADRA2C 和ADRB1 均参与心肌收缩力、心率和血压的调节过程。TNF 参与心脏重塑的过程。这表明，与附子- 慢性心力衰竭相互交联的重叠靶标的生物学功能在治疗慢性心力衰竭中具有重要的作用[13-15]。研究证实，使用5-HT2B受体阻滞剂可明显改善心脏肥大的症状，减轻氧化应激反应的程度和细胞外细胞基质活化的程度。ADRB3 具有抑制心肌纤维化的作用[16-17]。内皮素拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、高级糖基化终产物抑制剂等治疗慢性心力衰竭和糖尿病相关性心脏病的药物大多作用于上述的途径。本次研究的结果表明，附子可作用于上述的多靶点、多通路，具有治疗慢性心力衰竭的潜在作用。

进行GO 分析的结果显示，附子治疗慢性心力衰竭的生物过程与其调节血管收缩、炎症反应发生、血压的水平及脂肪的分解、钙介导的信号传导、内分泌的过程、免疫反应等相关。进行KEGG 通路富集分析的结果显示，共筛选出4 条信号通路途经，包括IL-27 信号通路途径、IL-23信号通路途径、调控肾上腺皮质激素受体途经和调控生物胺结合受体途经。GO 和KEGG 富集的结果与附子- 慢性心力衰竭- 基因数据集涉及的生物功能相似。因此，我们推测，附子的活性成分可能通过作用于这些信号通路中的关键因子，达到治疗慢性心力衰竭相的目的。本研究应用网络药理学的方法对附子治疗慢性心力衰竭的多成分、多靶点、多途径进行了初步的探讨。本次研究的结果初步预测了附子治疗慢性心力衰竭的分子机制，为进一步探讨其作用机制提供了先导信息和基础，也为研究成分更为复杂的中药复方的作用机制提供了借鉴。