GPX4对erastin诱导的H9C2细胞脂质过氧化和铁死亡的影响及其机制

郑宪鑫 张京 肖丹丹 王建勋

(青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071)

铁死亡(ferroptosis)是一种依赖铁的程序性细胞死亡形式，其特征是谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)活性丧失和细胞内活性氧水平升高[1]。多种疾病与铁死亡有关，如神经系统疾病、肿瘤以及缺血再灌注引起的心血管系统疾病等[2-5]。因此，针对调控心肌细胞铁死亡的研究，对探讨心血管疾病新的治疗方法具有重要意义。

GPX4是铁死亡调控通路中关键调节因子，保护细胞免于脂质ROS伤害[6-7]。细胞内GPX4活性下降或GPX4直接降解会引发铁依赖性活性氧增加，进而诱发铁死亡[8-9]。GPX4介导的铁死亡在机体发育过程中具有多种作用。研究发现，GPX4基因敲除小鼠体内脂质ROS过量积累，可导致细胞铁死亡[10-11]；在体外大鼠心肌梗死模型中，心肌细胞中GPX4表达量降低[12]，说明GPX4也与心血管系统疾病密切相关。但GPX4在心肌细胞铁死亡发生过程中的具体作用还不明确。研究发现，核因子红细胞2相关因子2(NRF2)与肿瘤细胞铁死亡的负调节有关，通过敲除肿瘤细胞中的NRF2，能促进肿瘤细胞铁死亡[2,13]，而且NRF2对GPX4具有转录调控作用[14]。但NRF2与GPX4在心肌细胞脂质过氧化和铁死亡中的作用还有待进一步研究。本研究通过铁死亡诱导剂erastin诱导心肌细胞铁死亡，探究GPX4和NRF2对erastin诱导的心肌细胞脂质过氧化和铁死亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源

BODIPYTM581/591 C11及Lipofectamine3000(美国Invitrogen公司)，RNA反转试剂盒(日本TaKaRa公司)，GPX4单克隆抗体(美国Abcam公司)，NRF2单克隆抗体(中国ABclonal公司)，GPX4、NRF2以及GAPDH的引物(上海吉玛制药技术有限公司)，erastin、Ferrostatin-1(Fer-1)、Z-VAD-FMK(Z-VAD)、Deferoxamine(DFO)以及Necrostatin-1(Nec-1)(美国Abmole公司)，丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司)，GPX4过表达质粒(中国华大基因)，NRF2过表达质粒以及GPX4-RNAi(上海吉玛制药技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 将H9C2细胞接种于含体积分数0.10胎牛血清的高糖DMEM培养基中，并置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱内，培养至合适密度后用于后续实验。

1.2.2细胞分组 将每孔约5.0×105个H9C2细胞铺于6孔板内,待H9C2细胞融合度为40%左右时进行后续实验。将H9C2细胞分为6组，A组为对照组，B～F组分别为经erastin(5 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Fer-1(5 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+DFO(100 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Z-VAD(10 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Nec-1(50 μmol/L)处理组。同时，再将H9C2细胞分为5组，G～K组分别为经过erastin(5 μmol/L)+pc DNA3.1、erastin(5 μmol/L)+GPX4、erastin(5 μmol/L)+siGPX4-scr、erastin(5 μmol/L)+si-GPX4、erastin(5 μmol/L)+NRF2处理组。

1.2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测H9C2细胞中GPX4、NRF2 mRNA相对表达水平将每孔约5.0×105个H9C2细胞铺于6孔板内，按照1.2.2中A～C组的方法处理细胞24 h后，采用Trizol法提取常规培养细胞的总RNA，经逆转录合成cDNA，以此为模板进行RT-qPCR。根据试剂盒说明书配制反应体系，以GAPDH作为内参照，每个样品设3个复孔，实验重复3次。反应的条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。采用2-△△CT计算样本中GPX4以及NRF2 mRNA的相对表达水平。GPX4引物：正向5′-GAGGCAGGAGCCAGGAA-GT-3′，反向5′-ACAGTGGGTGGGCATCGTC-3′。NRF2引物：正向5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′，反向5′-GGAATGTCTGCGCCAAA-AGCTG-3′。GAPDH引物：正向5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，反向5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.2.4PI染色检测细胞死亡率 待H9C2细胞融合度为40%左右时，按照1.2.2中A～K组的方法处理细胞24 h后，弃掉培养基，用PBS洗涤3次，使用多聚甲醛对细胞固定超过30 min，固定完成后，吸出多聚甲醛，再使用PBS洗涤3次以后，按照Hoechst33342/PI双染试剂盒说明书操作，最后于荧光显微镜下检测细胞死亡情况。细胞死亡的百分比计算方法为细胞PI阳性数量除以Hoechst33342染色的细胞核总数。

1.2.5Western blot方法检测细胞中GPX4、NRF2蛋白相对表达量 待H9C2细胞融合度为40%左右时，按照1.2.2中A～C组的方法处理细胞24 h后，收集心肌细胞，提取细胞总蛋白。按照SDS-PAGE凝胶制备说明书配置150 g/L的分离胶以及50 g/L的浓缩胶，电泳、转膜，然后以50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1∶500)室温孵育2.5 h，同时以β-actin作为内参照。TBST洗膜3次后，二抗室温孵育1 h，重复上述洗膜步骤，显影，使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值计算，结果取3次重复实验的均值。

1.2.6荧光分光光度法检测细胞中MDA的含量将H9C2细胞接种于6孔板中，每孔约5×105个细胞，待细胞融合度为40%左右时，将细胞按照要求分为A～K组。处理24 h后，弃掉培养基，用PBS洗涤3次，根据MDA检测试剂盒说明书操作，收集细胞到离心管内，离心后弃上清液；按照每500万个细胞加入 1 mL提取液，超声波破碎细胞，最后使用荧光分光光度法测量细胞中MDA的含量。

1.2.7流式细胞术检测细胞脂质ROS的含量 将H9C2细胞接种于6孔板中，每孔约5×105个细胞，待细胞融合度为40%左右时，将细胞按照实验要求分为A～K组。处理24 h后，弃掉培养基，用PBS洗涤3次，根据BODIPYTM581/591 C11检测试剂盒说明书操作，收集细胞到离心管内，离心后弃上清液，PBS重悬，滤网过滤后使用流式细胞术检测脂质ROS的含量。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 Erastin及其抑制剂对H9C2细胞的死亡率及脂质过氧化的影响

经erastin及其抑制剂处理后进行PI染色，结果显示，C、D组细胞死亡数量很少，而E、F组可见大量细胞死亡(图1)；A～F组细胞死亡率以及脂质ROS、MDA含量比较，差异具有显著统计意义(F=22.380～259.500，P<0.05)，其中C、D组与B组比较，上述3个指标均明显降低(t=4.056～45.500,P<0.05)。见表1。

2.2 过表达GPX4对erastin诱导的H9C2细胞脂质过氧化和铁死亡的影响

经erastin及转染过表达GPX4质粒处理后，A、B、G、H组细胞死亡率及脂质ROS、MDA含量比较差异均有显著意义(F=4.069～488.900，P<0.05)，其中H组与G组比较，上述3个指标均明显降低(t=2.044～16.750,P<0.05)。见表1。

2.3 抑制GPX4对erastin诱导的H9C2细胞脂质过氧化和铁死亡的影响

经erastin及转染敲低GPX4的siRNA处理后，A、B、I、J组细胞死亡率及脂质ROS、MDA含量比较差异均有显著意义(F=19.880～363.200，P<0.05)，其中J组与I组比较，上述3个指标均明显升高(t=2.925～10.280,P<0.05)。见表1。

A～F分别为A～F组图1 A～F组H9C2细胞的死亡情况

2.4 过表达NRF2对erastin诱导的H9C2细胞脂质过氧化和铁死亡的影响

经erastin及转染过表达NRF2质粒处理后，A、B、G、K组细胞死亡率及脂质ROS、MDA含量比较差异有显著性(F=3.786～99.120，P<0.05)，其中K组与G组比较，上述3个指标均明显降低(t=1.873～8.315,P<0.05)。见表1。

表1 A～K组H9C2细胞脂质过氧化和铁死亡情况比较

2.5 Erastin及抑制剂Fer-1对H9C2细胞GPX4、NRF2 mRNA和蛋白相对表达水平的影响

经erastin及抑制剂Fer-1处理以后,A～C组H9C2细胞的GPX4、NRF2 mRNA和蛋白相对表达水平比较差异均具有显著性(F=8.277～42.570，P<0.05)，其中C组与B组比较，上述指标均明显升高(t=3.320～9.803,P<0.05)。见表2。

表2 A～C组H9C2细胞的GPX4、NRF2 mRNA和蛋白的相对表达水平比较

3 讨 论

心血管疾病是最常见和最具危害的疾病之一，严重威胁着人类的生命健康。现在越来越多的研究证据表明，铁代谢异常与心血管疾病密切相关。铁蛋白重链(FTH)在铁代谢和心脏疾病发病过程中中具有重要作用[15]。有研究证实，在特异性敲除心脏转铁蛋白受体(Tfr)基因的小鼠中，心脏缺铁严重，最后致小鼠死亡[16]。在特异性敲除心脏ATP结合转运蛋白(ABCB8)小鼠中，心肌细胞中出现铁蓄积，并最终发展为心肌病[17]。由此可以推测，铁缺乏和铁超载与心血管系统疾病的发生发展密切相关[18]。但是，铁参与心血管疾病的具体损伤机制目前仍不清楚，因此，该领域的研究将是未来心血管系统疾病治疗的新方向。

铁死亡是依赖于铁的一种新的程序性细胞死亡方式。铁死亡概念的提出，对解决铁代谢与心血管系统疾病的关系，提供了新的思路。研究报道抑制铁死亡可以减轻小鼠心脏缺血再灌注损伤[19]。铁死亡抑制剂Fer-1可以显著降低阿霉素导致的心肌毒性[20]。GPX4作为铁死亡调控通路中的关键调节因子，使用GPX4特异性抑制剂RSL3抑制其活性，或者RNA干扰抑制内源性GPX4的表达，都会导致肿瘤细胞脂质ROS积累触发铁死亡[21]。本研究经铁死亡抑制剂Fer-1处理H9C2细胞后，结果显示细胞死亡率及脂质ROS、MDA含量明显降低，表明Fer-1能够抑制erastin诱导的H9C2细胞死亡。为了探究GPX4在erastin诱导的H9C2细胞铁死亡中发挥的作用，本研究构建了GPX4过表达载体，将H9C2细胞经erastin及转染GPX4过表达质粒处理后，结果显示细胞死亡率以及脂质ROS、MDA含量均明显降低，提示过表达GPX4可以抑制erastin诱导的H9C2细胞铁死亡和脂质过氧化；同时本研究又构建了敲低GPX4的si-RNA， 在将H9C2细胞经erastin及si-GPX4处理后，结果显示细胞死亡率及脂质ROS、MDA含量均明显增高，提示抑制GPX4的内源性表达可以促进erastin诱导的H9C2细胞铁死亡和脂质过氧化。以上结果表明GPX4在erastin诱导的H9C2细胞铁死亡中发挥着保护作用。

NRF2是铁死亡中重要的转录调控因子，在铁、脂质和谷胱甘肽代谢中都发挥重要作用[22-24]。并且发现NRF2与阿尔茨海默病、呼吸系统疾病以及肿瘤等疾病也密切相关[14,22,25]。NRF2敲除的转基因小鼠的心脏梗死面积增加，表明NRF2与心血管系统疾病的发病密切相关[26]。据文献报道，GPX4是NRF2转录介导的基因，因此NRF2与GPX4存在靶向调控关系[14]，但是在心血管系统疾病中的作用还不是很清楚。为了进一步探究NRF2是否参与调控了GPX4的表达，本研究构建了NRF2的过表达的质粒，结果发现H9C2细胞经转染NRF2过表达质粒处理后，GPX4的表达也增加。H9C2细胞经erastin及转染过表达NRF2质粒处理后，细胞死亡率以及脂质ROS、MDA含量均明显降低，提示NRF2可以抑制erastin诱导的H9C2细胞铁死亡和脂质过氧化。为此推测NRF2对GPX4的调控是GPX4发挥保护作用的关键。

综上所述，本研究通过对H9C2细胞经erastin以及GPX4、NRF2进行过表达处理后，发现GPX4和NRF2均参与了调控erastin诱导的H9C2细胞脂质过氧化和铁死亡过程，NRF2可能是通过转录调控GPX4发挥作用的，本研究为心血管系统疾病铁死亡的研究提供了更多的理论依据。