高艺峻 贾凤菊 焦倩 陈曦 杜希恂 姜宏
(青岛大学国家生理学重点(培育)学科,山东 青岛 266071)
卵巢肿瘤结构域蛋白3(OTUD3)是去泛素化酶(DUBs)家族OTU亚家族中的一个成员,位于人类染色体1p36.13[1-2]。OTUD3不仅被证实参与肿瘤的发生发展[3-5],还可以通过抑制线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)Lys63位的多聚泛素化,进一步抑制MAVS的聚集,切断视黄酸诱导基因1(RIG-1)样受体(RLR)信号通路上的先天抗病毒免疫应答,从而限制了先天抗病毒免疫信号的传导[6-7]。为了更加全面地了解OTUD3对先天免疫应答中核因子κB(NF-κB)相关炎症因子的影响,本研究选用24月龄OTUD3敲除(OTUD3-/-)雄性小鼠及其同窝野生型(WT)雄性小鼠各3只,对6只小鼠的中脑黑质组织进行转录组学测序(RNA-seq)分析,筛选出差异表达基因(DEGs),并通过KEGG通路富集分析可能参与先天免疫和神经炎症相关的信号通路,同时采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验对筛选出的DEGs进行mRNA水平的验证,旨在探讨OTUD3对NF-κB相关炎症因子表达的影响,以及OTUD3参与调控神经炎症反应的作用机制。现将结果报告如下。
24月龄OTUD3-/-雄性小鼠3只,同窝WT雄性小鼠3只,体质量(30±2)g,均由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所、国家蛋白质科学中心(北京)提供。实验动物分为WT组与OTUD3-/-组,小鼠在室温(23±1)℃,湿度(50±10)%,12/12 h昼夜循环光照条件下饲养,并自由饮水、进食。所有动物的处理均遵循医学伦理及原则,伦理编号:201810OTUD3-/-3WT32019-03012。
水合氯醛、三氯甲烷(美国Sigma公司),TRIzol Reagent(美国Thermo fisher Scientific公司),逆转录试剂盒(AG11711,湖南艾科瑞生物工程有限公司),qPCR试剂盒(AG11701,湖南艾科瑞生物工程有限公司),S1000 Thermal Cycler PCR仪(美国BIO-RAD公司),CFX96TMReal-Time System(美国BIO-RAD公司)。
腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠后,迅速断头取脑,在冰上取出双侧黑质组织,并置于液氮罐中保存。测序样本使用干冰进行保存并送至深圳华大基因股份有限公司(以下简称华大基因)进行RNA-seq相关分析。
将取材后的WT小鼠和OTUD3-/-小鼠的黑质组织置于EP管中,加入TRIzol Reagent 500 μL,使用电动研磨棒研磨组织;匀浆化的样品室温温育5 min,使核蛋白复合物完全解离后,加入三氯甲烷150 μL,剧烈甩动离心管15 s,使其充分混匀,室温温育5 min;再于4 ℃下不超过12 000 r/min离心15 min;离心后混合物分为3相,RNA位于上层水相;将水相转移至新的离心管当中,加入异丙醇250 μL,沉淀RNA;室温温育10 min后,4 ℃下不超过12 000 r/min离心10 min;去上清液,加入体积分数0.75的乙醇溶液500 μL;涡旋振荡器处理样品,4 ℃下不超过7 000 r/min离心5 min;稍微晾干RNA,加入无酶无菌水10 μL使其全部溶解。
将提纯的RNA置于65 ℃的水浴条件下变性5 min,立即置于冰上。首先将gDNA Clean Reagent 1 μL,5×gDNA Clean Buffer 2 μL,总RNA 1 μg,后加入无酶无菌水至10 μL配成反应体系,42 ℃下反应 2 min,4 ℃下恒温维持以去除基因组DNA。再将上述反应液10 μL加入Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL,RT Primer Mix 1 μL,5×RTase Reaction Buffer Mix I 4 μL,加入无酶无菌水至20 μL配成逆转录反应体系,37 ℃下反应15 min,85 ℃下反应 5 s,后4 ℃下恒温维持完成逆转录反应。最后按照qPCR试剂盒说明书要求配制qPCR反应体系20 μL:2×SYBR©Green Pro Taq HS Premix 10 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,加入无酶无菌水至20 μL。上机反应:95 ℃预变性30 s;然后95 ℃扩增5 s,60 ℃延伸30 s,共进行40个循环;最后65 ℃退火15 s终止扩增反应。引物序列由湖南艾科瑞生物工程有限公司进行设计并合成。GAPDH上游引物序列:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,GAPDH下游引物序列:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′,LBP上游引物序列:5′-TCTCCAGACTCTGCCAGTCAC-3′,LBP下游引物序列:5′-CAACTGGAGAGCGG-TGATTCC-3′,COX2上游引物序列:5′-CTGGA-ACATGGACTCACTCAGTTTG-3′,COX2下游引物序列:5′-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′。
6只小鼠的测序错误率均低于1%,Clean reads的碱基含量均小于50,Q30约为91%,OTUD3-/-组与WT组间基因表达量的Pearson相关系数均大于0.86,数据的可靠性高,基因的相似性高,可进行后续分析。
OTUD3-/-组和WT组间共有274个DEGs,其中75个基因在WT组呈现高表达,199个基因在OTUD3-/-组呈现高表达。
分析结果显示,有4个DEGs富集到NF-κB通路上,其中脂多糖结合蛋白(LBP)、环氧合酶2(COX2)、C-C基序趋化因子19(CCL19)和细胞黏附因子1(ICAM1)的log2(OTUD3-/-/WT)值分别为2.13、1.42、3.50和1.07,与WT组相比,差异均具有显著性(P<0.05)。2个基因富集在NF-κB的经典通路上,分别为LBP和COX2,2个基因富集在NF-κB的非经典通路上,为CCL19和ICAM1。
结果显示,WT组LBPmRNA水平为0.67±0.05,OTUD3-/-组为2.70±0.22,组间比较差异具有统计学意义(t=7.81,P<0.05);WT组COX2 mRNA表达水平为1.00±0.02,OTUD3-/-组为1.15±0.04,组间比较差异具有显著意义(t=3.11,P<0.05)。
OTUD3是DUBs中第二大家族OTU家族成员之一,含有398个氨基酸,主要是由OTU结构域和UBA结构域组成,具有典型的半胱氨酸酶活性中心[1-2,7]。在人类基因组中约有100个活跃的DUBs参与疾病代谢过程,包括神经变性、炎症、感染和癌症等[10]。2003年,AMERIK等[11]在果蝇卵巢组织中首次发现了OTUD3。目前,国内外关于OTUD3功能的报道局限于OTUD3作为DUB的作用,如参与结肠癌[12]、乳腺癌[4]、肺癌[5]等癌症的发生等。此外,ZHANG等[6]发现当机体遭受外源性病毒感染时,OTUD3可以调控机体的先天抗病毒免疫应答反应。OTUD3-/-小鼠黑质NF-κB经典通路上的IKKε被激活,导致IKKε的上游信号衔接蛋白促炎症细胞因子(TNF)受体的结构发生改变[6,13-15],进而促使IKKε下游信号蛋白IκBα发生磷酸化和泛素化降解,NF-κB被激活并进入到细胞核内,从而调控下游靶基因的转录[16-18]。因此,IκBα的降解可以一定程度促使NF-κB激活。而在非经典通路上NF-κB主要通过调控p100、p52进入细胞核,p100是IκB蛋白的另一种形式,NF-κB可与p52形成二聚体穿过核膜进入细胞核,诱导NF-κB下游炎症因子的表达[19]。机体的先天免疫系统可以通过非特异性的方式抵御外来感染,NF-κB是调控这种复杂反应的关键转录因子之一[20]。
本研究RNA-seq结果显示,与NF-κB相关的4个炎症因子表达显著上调,经典通路上游因子LBP表达升高,下游炎症因子COX2表达升高,非经典通路的下游因子CCL19、ICAM1表达升高。其中,PARK等[21]发现LBP与脂多糖(LPS)具有高度亲和性,参与LPS诱导的炎症反应。XUE等[22]发现COX2可通过前列腺素和细胞因子的协同作用被诱导激活,通常在慢性炎症组织中高表达[23]。根据本研究结果,OTUD3-/-小鼠黑质LBP表达上调,这可能会加速细胞中IκBα蛋白的降解,促使NF-κB与其解离并进入细胞核,导致下游相关炎症因子COX2表达也上调,使得经典通路上NF-κB与p65/p50二聚体解离而进入细胞核内,导致下游的炎症因子表达升高。因此,LBP的表达上调可能是由于OTUD3-/-后,造成小鼠黑质NF-κB下游炎症因子表达上调的原因之一。
NF-κB非经典通路下游的炎症因子ICAM1在炎症过程中介导白细胞与血管内皮细胞的黏附,是神经细胞中参与信号转导、突触可塑性、学习记忆等过程的重要因子[24-25]。CCL19广泛参与慢性炎症反应的发生发展,且持续的炎症反应会导致其表达上调[26-29]。根据本实验结果,OTUD3-/-小鼠黑质ICAM1、CCL19的表达上调,表明NF-κB非经典通路被激活,参与了神经炎症反应的发生[30]。因此,OTUD3-/-小鼠黑质缺失OTUD3,会导致NF-κB下游炎症因子COX2、ICAM1以及CCL19的表达上调。
尽管本研究观察到OTUD3参与调控NF-κB相关炎症因子的表达,并明确了OTUD3-/-小鼠黑质中LBP和COX2 mRNA表达水平上调,但其具体机制以及在神经免疫炎症反应中的作用还需进一步探讨。