基于网络药理学探讨小青龙汤治疗过敏性鼻炎的作用机制*

杨帆，朱恒，赵宵溢，王惠君

天津中医药大学，天津 301617

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，又称变应性鼻炎，是指由免疫球蛋白E介导的以鼻痒、鼻黏膜肿胀、鼻分泌亢进为主要临床特点的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病。随着人类社会工业化的进展，AR的发病率逐年增加[1]，已严重影响患者的生活质量[2]。AR的西医治疗主要有免疫疗法和药物治疗，但效果欠佳[3]。AR在中医学属于“鼻鼽”范畴，其病机为脏腑虚损、卫表不固，感受风寒邪气。而小青龙汤是治疗AR的经典名方，载于《伤寒论》，由8味药物组成，分别是北五味子、麻黄、炙甘草、干姜、桂枝、细辛、白芍药、半夏，主治表寒里饮之证。辜诗晶[4]应用循证医学和Meta分析得出，小青龙汤对改善AR症状和降低其复发率有明显优势。王胜军[5]研究发现，小青龙汤联合补中益气汤加减联合西医治疗AR比单纯西医有明显优势，治疗后鼻塞、流清涕等症状有显著改善。王超群等[6]以门诊治疗的100例AR患者为研究对象，经分析得出小青龙汤加减治疗AR的效果显著，可明显缓解本病症状，建议在临床推广使用。

中药的化学成分复杂，其分子机理尚缺乏有效方法进行阐释，随着网络药理学的广泛应用，也被视为适合中医药的研究手段，它的整体性、综合性和系统性符合中药的多化合物、多靶点、多途径的特点[7]。现应用网络药理学研究小青龙汤治疗AR的作用机制，旨在为其临床应用提供一定的理论支撑。

1 方法

1.1 筛选小青龙汤中药物的有效成分本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)获取小青龙汤中每味中药的化学成分，且均以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件，得到每味中药的有效成分信息。

1.2 获取相关靶点信息采用Uniprot数据库(www.uniprot.org)对获取的蛋白质名称进行基因注释，得到蛋白质的标准化基因名称，物种设定为人，并将所有结果去重复后保存。

1.3 收集AR的靶点信息分别在GeneCards数据库、OMIM数据库中以Allergic Rhinitis为关键词进行检索，将得到的结果合并去重复保存到Excel中。

1.4 将小青龙汤中药物的靶基因和AR的靶基因取交集搜索在线韦恩图(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，在Upload lists下一栏的List1中导入AR的基因信息，在List2中导入小青龙汤的基因信息，点击submit，即可得到小青龙汤治疗AR的交集基因。

1.5 网络的构建及关键靶点的筛选根据复方的基因信息整理出Network文件和Type文件，将两个文件导入Cytoscape3.7.1软件，通过分析得到药物-复方有效成分-靶点网络。进入STRING数据库，点击左侧的Multiple proteins，将复方和AR的交集基因导入List Of Names一栏中，Organism选择Homo sapiens，点击SEARCH，隐藏游离靶点，得到一份tsv文件，将此文件导入到Cytoscape3.7.1软件进行分析。一般认为，节点度值大于所有节点连接度2倍中位数对网络具有重要意义，以此为筛选条件确定关键节点[8]，并运用CytoNCA对网络进行拓扑分析。

1.6 交集基因的功能富集分析和通路富集分析通过Metascape(https：//metascape.org/)平台对小青龙汤和AR的交集基因进行GO和KEGG富集分析。

2 结果

2.1 小青龙汤中药物的有效成分的筛选及靶点预测通过TCMSP数据库，且以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件得到小青龙汤的有效成分共169个，其中甘草92个、麻黄23个、芍药13个、半夏13个、细辛8个、五味子8个、桂枝7个、干姜5个。经Uniprot数据库分析后，得到841个靶点，其中甘草226个、麻黄221个、细辛106个、半夏92个、芍药88个、桂枝48个、干姜42个、五味子18个。去重复后共272个靶点。

2.2 AR疾病的靶点预测在Genecards、OMIM数据库中均以Allergic Rhinitis为关键词进行检索，分别得到过敏性鼻炎疾病的相关基因2 073个和138个，去重复后得到基因共2 140个。

2.3 小青龙汤治疗AR的潜在靶点预测将小青龙汤的活性成分靶点和AR的靶点在韦恩图进行映射，获得两者的交集靶点122个，即小青龙汤治疗AR的潜在靶点。如图1。

图1 小青龙汤和AR的交集靶点数

2.4 网络的构建及关键靶点的筛选将复方的Network文件和Type文件导入到Cytoscape软件中，经调整处理后可得到小青龙汤的药物-复方有效成分-靶点图(图2)，其中涉及332个节点、909条边，且节点越大，度值越大，即在网络中的作用就越重要。将小青龙汤和AR的交集基因导入STRING数据库后得到一份tsv文件，把此文件再导入软件Cytoscape软件进行分析后，构建蛋白互作网络，并运用软件中的CytoNCA插件对网络进行拓扑分析计算出各节点的点度中心性值、中介中心性值、接近中心性值。确定节点度值大于所有节点连接度 2 倍中位数的靶点为小青龙汤治疗AR的关键靶点，见表1。并得到最终的PPI网络图，见图3。在网络中节点的大小、节点间连线的粗细均与度值成正相关。

表1 小青龙汤治疗AR关键靶点的网络拓扑参数

图2 小青龙汤的药物-复方有效成分-靶点的网络图

2.5 潜在靶点的基因功能富集分析结果和通路富集分析结果运用Metascape对122个潜在靶点进行GO富集分析，包括分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cellular component，CC)、生物过程(biological process，BP)。其中MF含有140条信息，CC含有81条信息，BP含有2199条信息。以P<0.01作为筛选条件，在BP、CC和MF中分别选取前20条绘制柱状图，见图4，X轴是基因数目(Count)，Y轴是GO信息名称(GO term)。通过Metascape进行KEGG通路富集分析获得182条通路(P<0.01)，其主要涉及到癌症通路、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、肿瘤坏死因子(TNF)、Toll样受体及PI3K-Akt等信号通路。根据P值从小到大选取前20条通路作图，见图5，图中X轴是基因所占比率，Y轴是通路的名称，气泡大小代表富集的基因数目(Count)，颜色的深浅表示P值的大小，P值越小颜色越红。

图3 小青龙汤治疗AR的关键靶点的PPI网络图

图4 潜在靶点GO功能富集分析

图5 潜在靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

AR的相关记载最早见于《礼记·月令》，称为“鼽嚏”，发作时以鼻痒、打喷嚏、流清涕为主要症状，或有嗅觉减退、耳痒、咽痒等，本病易反复，多与肺、脾、肾等脏腑相关，部分患者可有哮喘、鼻息肉等并发症[9-10]。肺虚则卫外不固，易感受寒邪，脾虚则水湿不运，肾虚易致喘咳，符合小青龙汤外寒里饮证的病机特点，故临床多用小青龙汤治疗AR。AR的发病机制复杂，主要与嗜酸性粒细胞浸润、核转录因子κB(inuclear factor kappa-B,NF-κB)表达、TH1/TH2失衡等有关[11]。

本研究筛选出小青龙汤共169个有效活性成分，相关靶点共272个，与AR的交集靶点共122个，关键靶点20个，涉及2420条GO生物信息和182条信号通路，说明小青龙汤治疗AR有多成分、多靶点、多通路的特点。

如图2小青龙汤的药物-复方有效成分-靶点的网络图所示，以“节点度值≥2倍度值中位数”为标准筛选出关键成分73个，有槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、柚皮素(naringenin)、黄芩素(baicalein)、木犀草素(luteolin)和异鼠李素(Isorhamnetin)等。槲皮素具有抗炎、抗肿瘤和调节免疫等作用，可通过调节 Th1和Th2细胞因子的表达来调节Th1/Th2细胞因子的平衡，从而达到对AR的保护[12]。山柰酚可降低鼻黏膜组织中TNF-α和IL-4的水平缓解AR的症状[13]。β-谷甾醇可通过抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体NLRP3的激活、抑制MAPK信号通路的活化、降低IL-6、TNF-α 水平从而起到抗炎作用[14]。柚皮素可通过抑制NF-κB信号传导途径发挥抗炎作用[15]。黄芩素可抑制鼻黏膜STAT3磷酸化的表达，减少中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，从而减轻AR的程度和炎症反应[16]。木犀草素具有抗过敏作用，可通过减少炎性细胞的浸润、抑制Th2细胞因子以达到对AR的治疗作用[17]。异鼠李素可抑制TNF-α和IL-6的水平以增强抗炎作用[18]。

本研究结果发现，小青龙汤治疗AR的关键靶点有20个，即EGF、MYC、IL-6、IL-10、CCL2、TNF-α、MAPK1、CXCL8等。其中IL-6既是免疫调节因子也是促炎因子，其作用机理是促进T、B细胞成熟，从而发生炎症反应[19]。IL-10是血清中免疫球蛋白E负反馈调节因子，能减少嗜酸性粒细胞的浸润，改善AR的症状[20]。CCL2属于趋化因子，对多种类型的免疫细胞具有强大的趋化性，从而介导多种促炎作用[21]。TNF-α是一种多功能炎症细胞因子，可有效抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎性因子的表达[22]。MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)可被多种细胞外信号或刺激(如炎性细胞因子、物理刺激等)所激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并与炎症等多种疾病相关[23]。CXCL8参与各级炎性过程，通过趋化作用调节免疫和炎性反应[24]。

经GO和KEGG富集分析得出，基因显著富集在癌症途径、IL-17信号通路、乙型肝炎、TNF信号通路、Th17细胞分化、Toll样受体信号通路(TLR)、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路等。IL-17信号通路主要是Th17细胞活化和维持的重要通路，其在多种炎性疾病中发挥关键作用[25]。Toll受体(TLRs)能间接调节Th1/Th2细胞因子的平衡，在AR的发生、发展中起着重要作用，TLRs介导的信号通路失调会导致自身免疫性疾病和炎症反应[26]。MAPK是人体内重要的细胞内信号传导通路，主要包括：c-Jun氨基末端激酶(JNK)/SPAK、ERK5、p38和细胞外信号调节激酶(ERK1/2)，其与感染、炎症等密切联系[27]。PI3K-Akt 信号通路在炎症中发挥重要作用，抑制此通路的活化及上下游调质的释放，可缓解炎症疼痛[28]。NF-κB是人体内重要的核转录因子，可参与众多免疫反应和炎症的表达，从而激活多种炎症细胞发生炎性反应[29]。

综上，本研究主要借助网络药理学得出小青龙汤中的槲皮素、山柰酚、黄芩素等有效成分可能是通过IL-17、Toll样受体、MAPK、P13K-Akt、NF-κB通路等多个通路作用于IL6、IL10、TNF、MAPK1和MAPK3等多个靶点，从而发挥治疗AR的作用，这为小青龙汤的临床应用提供一定的理论依据。