SBR工艺处理大蒜废水及污泥菌群结构研究

李 微，曾 飞，由 昆，傅金祥

(沈阳建筑大学市政与环境工程学院，辽宁 沈阳 110168)

大蒜易发霉变质难以长时间储存，为了改变这些缺点需要将大蒜进行深加工，近年来我国大蒜加工厂逐渐增多，随着大蒜产业的发展，大蒜废水问题随之而来，有关大蒜废水从2008年到2018年期间一直处于研究阶段[1]，还没有较为理想的处理工艺，大蒜废水含有高质量浓度的有机污染物、氮和磷等，因其含有具有杀菌作用的大蒜素使其更加难处理[2]，现有的处理方法包括物理方法，微电解的方法，活性污泥方法等[3-6]都有着一定的不足，活性污泥法一直是废水处理研究的热点，且该方法具有造价低，节省空间，耐冲击负荷高等特点，目前，活性污泥法处理高质量浓度大蒜加工废水的研究尚未处于初级研究阶段。傅源等[7]研究了活性污泥法处理1 000 mg/L COD质量浓度的大蒜废水，确定了活性污泥法处理大蒜废水的最佳工艺参数和影响因素，给出了处理大蒜废水时活性污泥法自然培菌和接种培菌的方案选择，实现达标排放。冯露[5]确定了活性污泥法的最佳运行温度，进水质量浓度及污泥形态等的变化，提出了合理可行的预处理方案，主要的预处理方法是以加热为主。在活性污泥的基础上，郑庆柱等[8]采用CABR+SBR的联合工艺，缩短了启动时间并且研究了该组合工艺对大蒜废水各指标的去除效果。针对大蒜废水的研究普遍有机负荷低，预处理费用高等问题，笔者研究了活性污泥法处理大蒜废水的可行性，对比研究了自然培菌和接种培菌两种培养方式对大蒜废水的处理效果，结合高通量技术分析两种不同驯化方式下污泥的菌群结构，旨在为处理高质量浓度大蒜加工废水快速驯化方法，实现反应器的快速启动，推动处理高质量浓度大蒜加工废水技术实际应用提供支持。

1 试 验

1.1 试验水质

模拟废水主要是通过模拟实际生产加工中切片清洗和离心分离产生的高质量浓度大蒜加工废水，将市场购来大蒜用榨汁机榨汁备用，配置模拟废水水质如表1所示。

表1 模拟大蒜加工废水水质Table 1 Simulated wastewater quality in garlic processing

1.2 分析项目与检测方法

试验检测项目及其检测方法如表2所示。

表2 主要分析项目及检测方法Table 2 Main analytical items and methods of determination

高通量测序分析方法:使用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒精确定量基因组DNA，以确定PCR反应应加入的DNA量，采用引物对341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)与805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)对16SrDNA基于V3-V4区序列进行扩增，第一轮扩增PCR体系为30 μL，包括2×Taqmaster Mix 15 μL,前后引物各1.0 μL，细菌组的DNA10-20 ng，最后以H2O补足至30 μL,配置好的PCR体系按照扩增条件为：94 ℃首次变性3 min，94 ℃、30 s，45 ℃、20 s,65 ℃、30 s进行5个循环；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s进行20个循环；在72 ℃下延伸5 min直到10 ℃,随后以Illumina桥式PCR作为引物，开始第二轮扩增，PCR体系和第一轮扩增相同为30 μL，同时也包括2×Taqmaster Mix 15 μL,前后引物各1.0 μL，第一次扩增得到产物20ng，最后以H2O补足至30 μL,配置好的PCR体系按照扩增条件为：95 ℃首次变性3 min，94 ℃、20 s，55 ℃、20 s,72 ℃、30 s进行5个循环；在72 ℃下延伸5 min至10 ℃后，将扩增的样品进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增产物，然后定量混合，最终的上机测得值为20 pmol，最后样品通过Miseq测序技术进行高通量测序。

1.3 试验装置

缺氧/好氧SBR反应器如图1所示。

1.电动搅拌机；2.搅拌桨；3.微孔曝气盘；4.气体流量计；5.空气泵；6.时控开关；7.排水接样口；8.排泥口；9.pH在线监测仪；10.DO在线监测仪；11.进水箱；12.电磁阀；13.水泵；14.进水口。

图1 缺氧/好氧SBR反应器
Fig.1 Anoxic/aerobic SBR reactor

试验采用两个有效容积分别为15 L的有机玻璃柱来模拟缺氧/好氧交替运行的SBR反应器A和B。由于两个反应器在运行方式和外部结构上完全相同，故取其中一个做以说明。反应器顶部装有时控开关和电动搅拌器,在反应器外侧每隔10 cm设有一个接样口，底部设有连接空气泵和时控开关的橡胶曝气盘，同时还外接了气体流量计用以控制水中溶解氧含量，在最底端设有两个排泥口，同时还设有溶解氧在线监测仪和pH在线监测仪。

1.4 试验运行方式

接种培菌方式主要是将取自城市污水处理厂的污泥去培养和驯化出最适合处理大蒜废水的微生物以及菌群类型[6]，将质量浓度为4 000 mg/L左右的种泥接种在A号SBR反应器中，调节进水大蒜废水pH在7.0左右，以瞬时进水10 min、厌氧3 h、好氧7 h、沉淀45 min、排水5 min的运行模式每天运行两个个周期，连续培养了60 d。

自然培菌法与接种培菌法最主要的区别就是没有外来种泥的介入，利用大蒜废水中本身具有的少量微生物驯化出能够适应大蒜废水的微生物和菌群类型[6]，起初将COD质量浓度为5 000 mg/L左右的大蒜加工废水注入B号SBR反应器中，以厌氧3 h、好氧7 h、沉淀45 min的运行模式反复运行，经过21 d的往复培养，在反应器底部发现少量沉积物，然后以瞬时进水10 min、厌氧3 h、好氧7 h、沉淀45 min、排水5 min的运行模式每天运行两个周期，进水大蒜废水COD质量浓度范围控制在5 000～9 000 mg/L,连续运行了40 d。

2 结果分析

2.1 两种培菌方式对大蒜废水中COD的去除效果

两种培菌方式对高质量浓度大蒜废水COD去除效果如图2所示。从图2(a)可以看出，接种培菌法初始进水COD质量浓度为60 mg/L，运行前7 d进水COD质量浓度每次递增20 mg/L左右，到第7天时COD质量浓度由142.76 mg/L降到了20.21 mg/L，COD去除率为85.84%，COD去除率逐渐提高，同时污泥由棕黑色逐渐变为黄褐色，表明污泥逐渐适应了大蒜废水水质，并且其降解能力也逐渐提高，污泥性状稳定且沉降性较好。大蒜加工废水COD去除率稳定在85%以上认定接种培菌法污泥驯化成功[ 8]。从第8天起，进水COD质量浓度每天约增加100 mg/L，反应进行第48天时，COD质量浓度提高6 129.31 mg/L降到了98.29 mg/L，废水COD去除率可达98.40%，进水COD废水去除率不断提高，最终稳定在97%左右。导致COD去除率下降的原因是大蒜素含量随着蒜汁比例的增加而增加，由于大蒜素的杀菌作用影响了生物活性使得COD去除率有所下降[9]。

从图2(b)可以看出，SBR启动21 d后，反应器底部出现少量沉积物，自然培菌法开始进水，最初进水COD质量浓度为5 000 mg/L，试验进水COD每天递增100 mg/L左右，第24天时废水COD质量浓度由5180.96 mg/L降到672.186 mg/L，COD去除率为87.03%，COD去除率逐渐提高，且沉积物由白色变为绿色在变为黄褐色且沉降性较好，至此自然驯化培菌方式启动成功。第30天时废水COD质量浓度由6 096.68 mg/L降到了106.18 mg/L，COD去除率为98.42%，随着进水COD质量浓度的不断提高，COD去除率开始下降，并稳定在88%左右。下降的原因可能是废水中大蒜素含量增加导致。

图2 两种接种方式对COD的去除效果Fig.2 Removal effect of COD in the reactors with two vaccination methods

2.2 两种培菌方法对废水中TN的去除效果

图3 两种接种方法对TN的去除效果Fig.3 Removal effect of TN in the reactors with two vaccination methods

2.3 两种培菌方法对废水中TP的去除效果

生物除磷主要是由聚磷菌在厌氧条件自身的ATP水解为H3PO4和能量形成ADP，然后在好氧条件下由于聚磷菌在透膜酶的催化作用下利用厌氧过程产生能量从外部摄取厌氧过程产生H3PO4，在这个过程中一部分与ADP将结合形成ATP，另一部分将合成聚磷酸盐储存在细胞内，实现吸磷的作用[12]。为了彻底将磷从系统内排除，会不定期地通过预留排泥口将富余的污泥排除，以此达到除磷的目的。具体TP的处理效果如图4所示。

图4 两种接种方法对TP的去除效果Fig.4 Removal effect of TP in the reactors with two vaccination methods

反应器A、B均在厌氧好氧条件下交替运行，聚磷菌在好氧状态下吸磷，停止曝气后排出上清液，聚磷菌吸收的磷随剩余污泥排放，又因为A、B反应器中污泥质量浓度较高，聚磷菌吸磷效果明显，因此A、B反应器对TP 的去除率都较高[13]。由图4(a)可知，在A、B反应器进水COD质量浓度相同的情况下，进水TP的质量浓度随着大蒜汁比例增加而增加，TP的进水为8～14 mg/L，反应器A在连续运行60 d后出水TP平均质量浓度为0.27 mg/L，此时TP的平均去除率为94.98%。对比图4(b)，反应器B在连续运行60 d后，出水TP的平均质量浓度为0.37 mg/L，TP的平均去除率为94.01%，和反应器A的去除效果相近，都可以达到排放标准。

2.4 微生物多样性和群落结构分析

2.4.1 微生物多样性

试验分别对污水厂种泥(H1),接种培菌法驯化第60 d的污泥(H2),自然培菌法驯化成熟的污泥(H3)，进行了高通量测序，经过降噪等过滤后共获得了195 811条有效序列，其中H1、H2、H3样品中有效序列分别为105 289、4 529、44 993条，各样品的微生物多样性指数如表3所示。覆盖率反映测序结果是否代表样本的实际情况，值越高则样本中序列未被检测到的概率越低[14]，3个样品的覆盖率都大于0.95，这说明所有样品中测序所得序列能够覆盖绝大部分区域，测序结果可以反应样品的真实情况。在生态学中物种通常用ACE(丰度指数)和Chao1(丰富度估计量)来反应菌群丰度[15]，在相似度为97%的条件下，ACE指数H1>H3>H2,Chao1指数H1>H3>H2，实际获得OTU(非靶区域序列数目)为H1>H2>H3，由于测序深度的原因，ACE指数与Chao1指数与实际获得的OTU指数并不完全一致。由于每一个OTU通常被视为一个微生物物种，所以试验以OTU指数为参比进行分析，从3个样品的OTU指数可以发现，H3生物丰度最低，H1的OTU指数远远大于H2的OTU指数，这是因为大蒜废水中含有的大蒜素对细菌具有灭活和抑制的作用，而H2的OTU指数要大于H3的OTU指数，这是因为从污水厂取来的接种污泥本身含有的细菌总数要大于高质量浓度大蒜废水中所含的细菌总数。

Shannon(多样性指数)和Simpson(辛普森多样性指数)反映样品微生物多样性的常用指标,Shannon值越大，微生物多样性越高，反之Simpson指数值越小大，微生物多样性越低[15],从表3可以看出Shannon指数H1>H2>H3,而Simpson指数H1

表3 样品多样性指数表Table 3 Sample diversity index table

2.4.2 微生物群落结构

表4为经过Miseq高通量测序，经过分析后得到的样品H1、H2、H3中细菌门的分类情况。可以看出，3个样品中的细菌微生物丰度较大，但主要菌门有所差异但也比较相似，在H1中，Proteobacteria所占比例最高，达到了48.53%，其次是Bacteroidetes和Planctomycetes，这3个菌门占了总数的73.15%。而在H2中，Proteobacteria所占比例依然是最高，达到了45.49%，其次是CandidatusSaccharibacteria和Bacteroidetes这3个菌门占了总数的81.07%。在H3中，Proteobacteria所占比例依然是最高，达到了52.81%，其次是Bacteroidetes和Actinobacteria，这3个菌门占了总数的91.95%，其中Proteobacteria是活性污泥中比较常见的细菌[16-17]，金浩等[18]研究了污水处理厂活性污泥的微生物多样性，结果表明活性污泥中Proteobacteria菌门比例为91.9%。由于接种活性污泥是从污水厂取回后闲置了一段时间，低能供应和缺氧/厌氧环境在一定程度上改变了污泥中微生物群落结构。可以看出试验在反应器运行过程中Planctomycetes、CandidatusSaccharibacteria以及Actinobacteria逐渐成为系统内的主要菌门，对污染物去除发挥各自的作用。此外，对比H1与H2，CandidatusSaccharibacteria菌门所占比列逐渐提高，从0.66%逐渐增长到24.05%，原有的Proteobacteria，Bacteroidetes和Planctomycetes菌门比列都有所下降，这说明高质量浓度大蒜加工废水有利于CandidatusSaccharibacteria菌门的生长，相反对Proteobacteria，Bacteroidetes和Planctomycetes菌门的生长都有一定的影响。从表4可以看出H2和H3活性污泥的微生物群落结构，在H3中Proteobacteria，Bacteroidetes和Actinobacteria菌门所占数均大于H2中数量，其中Actinobacteria菌门最为显著，前者为1.72%，后者为18.04%，说明自然培养法更有利Actinobacteria菌门的生长。而CandidatusSaccharibacteria菌门在接种污泥系统中比例明显高于自然培养系统，说明自然培菌法所驯化的活性污泥不利于CandidatusSaccharibacteria菌门的生长，反映了两种培菌驯化方式在微生物结构上的差异[19-21]。

表4 门水平微生物群落结构Table 4 In phylum level microbial community structure

3 结 论

(1)接种培菌法启动只需7 d，而自然培菌法启动要24 d才能完成。

(2)接种培菌法和自然培菌法处理模拟大蒜废水对TN和TP的去除效能相近，对COD去除效果存在差异，接种培菌法处理模拟大蒜废水COD最高阈值为6 129.31 mg/L，出水可以达到国家二级排放标准要求，自然培菌水则达不到要求。

(3)在“门”和“纲”级别上接种培菌法的污泥样品分别以Proteobacteria和CandidatusSaccharibacteria两个菌门和Alphaproteobacteria、unclassifie以及Planctomyceti 3个菌纲占主导而自然培菌法的污泥样品分别以Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria3个菌门和Alphaproteobacteria、Actinobacteria、Flavobacteriia 3个菌纲占主导。