人微小病毒 B19荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

许良云,张其刚,范广来,赵建华

(1.南京医科大学第四临床医学院附属肿瘤医院,江苏 南京,210009; 2.江苏省淮安市妇幼保健院 基因检测技术应用示范中心,江苏 淮安,223002)

人微小病毒B19(HPV B19)属于微小病毒科、微小病毒亚科、红病毒属，最早于1975年被发现[1-3]。HPV B19呈二十面体，直径为22～24 nm,是一种无包膜的单链、线性DNA病毒。HPV B19感染可引起胎儿水肿、再生障碍性贫血、肾小球病等[4-5]多种疾病。HPV B19基因组有2个开放阅读框(ORF),左端ORF编码对宿主细胞有细胞毒性的结构蛋白NS1,该序列高度保守;右端ORF编码该病毒的结构蛋白VP1和VP2,VP1和VP2序列为高变区。

HPV B19以呼吸道传播为主，常在冬季和春季流行，流行病学爆发的周期一般为3～5年，但偶发病例可在全年发生[6]。HPV B19的检测方法主要为特异性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)血清学检测和定量聚合酶链式反应(PCR)病毒核酸检测。本研究基于NS1保守区序列，建立HPV B19的通用型荧光定量PCR检测方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验室检测样本为单纯疱疹病毒(HSV) 2型、巨细胞病毒(CMV)、B族链球菌(GBS)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV) 阳性DNA样本以及反复流产妇女外周血标本。

1.2 主要仪器和试剂

Probe qPCR Mix(TakaRa,Code No.RR391A);细菌基因组DNA提取试剂盒 (北京天根生化公司,Code No.DP305-02);StepOnePlus荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司);Qubit 3核酸/蛋白质定量荧光计(美国Thermo Fisher公司);生物安全柜等。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针的设计:通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库查询HPV B19 3类基因型代表性的5株序列(GenBank:M13178;AY582162;AY044266;NC_004295;AY582153),运用在线工具MAFFT(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)比对NS1区序列，选取保守区序列设计引物和探针。见表1。

表1 HPV B19实时荧光定量PCR检测的引物及探针

1.3.2 制备质粒:按照病毒株M13178的序列，由上海生工生物合成引物扩增区的寡核苷酸序列，将该片段插入到pUC57载体中获得HPV B19质粒，质粒全长为2912 bp。将此质粒转化入大肠杆菌，过夜培养后提取质粒DNA。经凝胶电泳分析及Qubit核酸/蛋白质定量荧光计测定质粒DNA的质量和浓度，于-20 ℃保存备用。根据质粒DNA大小、浓度以及脱氧核苷酸碱基的平均分子量计算质粒DNA的拷贝数(1 ng≈3.18×108拷贝)。

1.3.3 质粒分子适用性鉴定:对质粒DNA分子进行PCR扩增，电泳分析及Sanger测序，并与病毒株M13178的序列进行序列比对。以104拷贝/μL的质粒DNA为模板，在StepOnePlus荧光定量PCR仪上优化荧光定量PCR反应体系的引物探针比例，每个组合设4个平行重复，共15组。按照10倍梯度稀释，将质粒分子DNA稀释至107、106、105、104、103和102拷贝/μL以及20拷贝/μL,进行实时荧光PCR扩增，每个浓度梯度设3个平行重复，计算R2和反应效率(E),制作标准曲线。反应效率E计算公式为E=10-1/K-1(K为标准曲线斜率)。以10拷贝/μL和1拷贝/μL质粒分子DNA为模板，扩增20次反应检测质粒分子用于确定实时荧光PCR检测的检测下限(LOQ)。

1.3.4 反复流产妇女外周血HPV B19的检测:使用定量PCR方法对34份排除了染色体核型异常以及弓形虫(Tox)、风疹病毒(RV)、CMV和HSV感染的反复流产孕妇外周血样本进行HPV B19检测。

1.3.5 特异性鉴定:应用阳性HSV 2型、CMV、GBS、HBV和 EBV确定本研究方法的特异性，同时设置阴性、阳性对照(参考质粒及HPV B19阳性样本)。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR反应体系优化

质粒DNA分子PCR扩增后电泳条带单一(图1)。Sanger测序结果对表明，质粒DNA分子的序列与病毒株M13178的序列一致(图2)。体系优化的15组反应中，引物/探针体积比为0.4～0.8 μL的4个重复CT值最小，扩增效率最高,11组与该组比较差异有统计学意义，其中9组有显著差异，剩余3组无差异(图3A)。因此，本研究中最优的引物/探针体积比为0.4～0.8 μL。最终反应体系为1×Probe qPCR Mix,上下游10 μmol/L引物各0.4 μL,10 μmol/L探针0.8 μL、1×ROX Reference Dye、模板2 μL、加无菌水至20 μL。实时荧光PCR扩增程序为95 ℃ 20 s;95 ℃ 1 s、60 ℃ 20 s,40个循环。

2.2 HBV B19通用核酸检测体系标准曲线的建立

以浓度分别为107、106、105、104、103、102拷贝/μL和20拷贝/μL质粒DNA分子构建相对标准曲线(图3B)。各个浓度扩增的线性关系较好，阴性对照无扩增曲线，标准曲线的反应效率E为0.946,R2为0.996。

2.3 敏感性和特异性

质粒DNA浓度为10拷贝/μL的20次扩增均能被检出，质粒DNA浓度为1拷贝/μL无法扩增。结合标准曲线的结果表明，本研究建立的实时荧光检测方法的检测下限为10拷贝/μL,定量下限为20拷贝/μL。本检测方法具有较高的敏感性。34份反复流产妇女外周血标本中检出HPV B19核酸阳性1例。阳性HSV 2型、CMV、GBS、HBV和EBV及阴性对照均无扩增反应，参考质粒及HPV B19阳性样本正常扩增(图3C)。本检测方法具有较高的特异性。

3 讨 论

HPV B19感染可引起多种临床表现，其与被感染者的年龄和免疫状态相关。HPV B19感染率高，研究[7-9]表明孕期女性血清学阳性率可占47%～65%。此外，中国血液制品中HPV B19污染情况较为严重。武汉市无偿献血者血清中HPV B19DNA阳性率达20.9%[10]。相关研究[11]检测了来自中国3个地区的235份血浆中HPV B19 DNA,结果表明,71.91%的血浆存在HPV B19污染。因此,HPV B19的检测和筛查具有迫切性。

基于分子生物学特性,HPV B19检测方法主要针对其抗体和核酸，前者包括酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、免疫印迹法(Western blot)等对特异IgM、IgG抗体进行检测，后者包括普通PCR法、探针法、巢式RCR法和实时荧光定量PCR等。其他方法包括血清电子镜检查以及针对HPV B19抗原检测方法。目前，应用最广泛的为针对特异 IgM、IgG抗体检测以及实时荧光定量PCR方法。

患者在感染HPV B19 5～10 d,病毒快速复制，此时具有传染性，血清电子镜检查可呈现阳性;然而，此时产生的IgM和IgG较少，且与已快速复制的病毒颗粒形成免疫复合物，故可能无法检出IgM和IgG,可呈假阴性[12]。在HPV B19感染10～12 d后，检测IgM抗体可为阳性，并能持续数月。基于PCR技术的检测方法具有最长的窗口期，从HPV B19的感染初期就能检出。其中，实时定量PCR检测技术具有操作简便、高特异性和敏感性等优点，广泛应用于包括HPV B19在内的多种病原微生物的检测[13-14]。然而，定量PCR检测有假阳性可能，即检测的可能为裸露的病毒DNA,而非具有致病性的病毒颗粒。研究[15]表明,HPV B19也可以通过涉及热敏补体因子C1q增强的抗体介导的内吞作用进入细胞。急性感染期伴病毒血症高水平的HPV B19能以低效率的形式进入其他类型细胞，并在细胞中持续存在，当这些细胞死亡时，裸露的HPV B19 DNA被释放进入血液循环。

本研究通过比对5株代表型HPV B19的NS1区域序列，针对保守区序列设计了引物探针，建立了HPV B19通用型实时荧光检测方法，该方法敏感性较高且特异性较强，可应用于HPV B19的检测和筛查，对于临床患者的辅助诊断、高危人群感染的监测以及保障输血安全具有重要意义。后续研究中将扩大检测量，并分析笔者所在地区育龄期反复流产女性与HPV B19感染的相关性;建立可检测HPV B19完整病毒颗粒的荧光定量PCR方法，以减少假阳性的发生，同时可鉴别出为新近感染或慢性既往感染。