低共熔溶剂提取天然产物的研究进展

王新茗，马天宇，徐丽华，王 晓*

（1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东 济南 250014）

天然产物是指动物、植物和微生物体内的活性成分及代谢产物等，包括黄酮类、木质素类、酚类、生物碱类、多糖类、精油类等化合物[1]。作为主要原料或添加剂，天然产物已广泛应用于食品、饮料、药品、化妆品等领域。天然产物的传统提取溶剂多为乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂，而有机溶剂提取普遍存在提取耗时长，消耗溶剂量大，提取效率低，对环境污染严重等问题。随着人们的环境保护意识逐渐深刻，对天然产物的提取用溶剂提出了更高的要求，探索能替代传统溶剂的新型绿色溶剂成为天然产物提取的热点问题。

离子液体（ionic liquid，IL）是一种熔点接近或低于室温的绿色溶剂，与传统的有机溶剂相比，它具有低毒、环保、可回收、结构和性能可调节等特点，在催化反应、电化学、分析化学、提取分离等领域应用广泛。但由于其成本较高，合成工序较为复杂，生物降解性差，且合成离子溶剂常用的吡啶、咪唑等仍具有不亚于有机溶剂的毒性，因此在实际应用中有一定的局限性[2-3]。一种性质与离子液体十分类似的新型溶剂——低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）在2003年由Abbott首次发现，该溶剂由氯化胆碱和尿素（摩尔比1:2）组成，熔点为12 ℃。与离子液体相比，低共熔溶剂还具有价廉易得、无毒环保、易于制备、可生物降解等优点[4-5]。随着公众对于“天然”、“环保”和“绿色”的要求不断提高，绿色化学成为近年的研究热点之一，低共熔溶剂作为一种无毒可降解的绿色溶剂，在有机合成、提取分离、环境分析、功能材料合成等领域都有广泛的应用。本文对低共熔溶剂提取天然产物的研究进行综述，以期为低共熔溶剂在天然产物提取方面的应用提供参考。

1 低共熔溶剂的组成和制备

低共熔溶剂通常是由一定摩尔比的氢键供体（hydrogen-bond donor，HBD）和氢键受体（hydrogen-bond acceptor，HBA）通过分子间氢键形成的室温条件下呈液态的均一混合物。其中的氢键供体常选用有机酸、多元醇、酰胺类和糖类等，氢键受体常用季铵碱、氨基酸、金属离子等[6-7]。常见的低共熔溶剂分类见表1。

表1 低共熔溶剂的分类[6]

制备DES常使用加热制备和冷冻干燥两种方法。其中加热制备法是在一定温度条件下将氢键供体和氢键受体混合均匀的制备方法；而冷冻干燥法是将各组分分别溶于水后合并并混匀、低温冷冻，待呈澄清黏稠时进行干燥。目前的研究中多使用加热制备法进行制备。

2 低共熔溶剂的性质

与离子液体一样，低共熔溶剂也具有许多特殊的理化性质，且随组分的种类和摩尔比不同，理化性质也有以下差异：（1）熔点：大多数情况下，DES的熔点较低且低于任一组分，大多在-66～150 ℃范围内[8]。这一性质主要是氢键供体和氢键受体之间形成了氢键网络，使离子出现电荷离域所形成的；此外，DES组分的化学计量比也会影响其熔点。熔点越低，越有利于提取过程中介质的传输，因此熔点较低的DES在提取分离中有更为广泛的应用[9]。（2）黏度：DES一般黏度较高（＞100 cP）[10]。Abbott等[11]在研究氯化胆碱与羧酸形成的DES时，发现其黏度主要受离子的流动性和空穴效应的影响。同时，DES中各组分之间大量的氢键网络结构、范德华力及其他静电相互作用力也大大降低了它的流动性。在一些萃取过程，如单滴液相微萃取（SDME）中，高黏度有利于萃取液在针尖形成较大的悬浮液滴，对提取起到积极作用[7]。但在大多数的提取应用中，高黏度的DES往往会对目标化合物的扩散产生负面影响，使其应用有一定的局限性。因此，在实际应用中，常通过加水对DES的黏度、极性等性质进行调整，以达最佳的提取效率。（3）导电性：DES与离子液体类似，也具有较高的导电性，其电导率范围多在0.028～52 mS/cm[8]。DES的导电性源于其中阴阳离子的移动传输电荷和体系内氢键网络的电子移动传输电荷。温度是影响DES电导率的主要因素，温度越高，氢键网络中电子传输效率越快，电导率越高。同时，氢键供体与氢键受体的摩尔比也对其电导率有一定影响。（4）表面张力：DES的表面张力大于多数传统分子溶剂、咪挫类离子液体等。其大小也主要取决于DES中分子间作用力的强弱，因此与黏度有相似的趋势，常随温度的升高而降低[12]，且随氢键供体的比例增加而降低。如氯化胆碱-尿素组成的DES中，氯化胆碱的摩尔比越大，分子间相互作用（如氢键网络）的强度降低，表面张力变小。（5）极性和溶解度：DES的极性范围较宽，主要与温度[13]、组成组分和氢键供体的分子结构有关。一般情况下，DES的极性随温度的升高而降低。同时，DES对金属氧化物、气体（尤其是CO2）、药物分子等都具有很好的溶解性能，因此DES常作为溶剂应用于提取分离过程。（6）含水量：在DES中添加一定比例的水可达到调节其物理化学性质的效果。Dai等[14]研究表明，少量的水能降低DES黏度。而电导率随含水量的增加而增大，并在达到10～100倍后下降。但由于DES组分间由氢键相连，因此水等高极性溶剂的存在不仅能改变其理化性质，还会对其提取能力产生影响[15]，当含水量在50 %以上时，HBA与HBD的相互作用随水的稀释而减弱甚至消失，因此在实际应用中合适的含水量十分重要[14]。（7）低毒性：DES毒性较低，且易于生物降解[16]。但有研究指出，DES的毒理学行为与其组成组分（HBD和HBA）的毒理学行为不同，其细胞毒性高于单个组分，DES对人和动物细胞的毒理作用仍待进一步研究[17]。

3 低共熔溶剂在天然产物提取中的应用

3.1 DES在黄酮类化合物提取中的应用

黄酮是以C6-C3-C6为基本骨架的一类化合物，具有抗癌、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病、抗炎镇痛、保肝护肝等药理作用[18-21]。对黄酮类化合物的提取分离一直是研究人员关注的热点。Ahmad等[22]采用超声辅助DES提取荞麦芽中主要黄酮化合物，并对18种不同的氯化胆碱型DES的提取能力进行了评价和优化，最终选取了含水量为20 %的氯化胆碱-三乙二醇（摩尔比1:4），该溶剂对荞麦芽中黄酮的提取效率显著高于试验中其他DES（P＜ 0.05），且对杜荆素和芦丁的提取率显著高于传统提取溶剂甲醇（P＜ 0.05）。该研究指出，这是由于氯化胆碱-三乙二醇DES中缺少HBD组分，且三乙二醇缺少包封氯离子的支链，从而增强了黄酮类与氯离子之间亲和力。采用响应面法对试验条件进行优化：最优提取温度为56 ℃，提取时间为40 min。用C18柱固相萃取可对DES中的黄酮类化合物进行高效回收，回收率可达97 %。这为基于绿色提取法从植物原料中提取黄酮类化合物提供了一种高效、便捷的选择。

Cui等[23]采用微波辅助低共熔溶剂提取法（DES-MAE）对鸽豆根中的染料木漆（genistin）、染料木素（genistein）和芹菜素（apigenin）进行提取，通过响应面设计对试验条件进行优化：将含水量为30 %的己二醇-氯化胆碱（摩尔比7:1）组成的DES作为提取溶剂，在微波功率为600 W、液料比为14 ml/g、提取温度80 ℃、提取时间11 min的条件下，得到染料木漆、染料木素和芹菜素的提取率分别为0.499，0.617，0.221 mg/g。与热回流辅助和超声辅助提取相比，DES-MAE法提取效率高，提取时间短。

DES作为提取溶剂可增加活性组分的溶解度。Zhang等[24]建立了一种运用天然低共熔溶剂（NADES）从槐花中提取芦丁的方法。与水提法相比，芦丁在选用的11种NADES中的溶解度增加了67～3116倍，提取效率最高的是摩尔为1:1的氯化胆碱-三甘醇[提取率：（280.4±2.7）mg/ml]。

花青素及其衍生物作为一种离子型的黄酮类化合物，多具有较强的自由基清除能力，是一类优秀的天然抗氧化剂。Cao等[25]采用氯化胆碱-丙二酸组成的DES（Ch-M55）对银杏叶中原花青素（PAC）进行提取，并用响应面法对提取条件进行优化：氯化胆碱-丙二酸（摩尔比1:2），含水量55 %，提取温度65 ℃，提取时间53 min，液料比10.57 ml/g，提取率高达（22.19±0.71）mg/g，远高于传统有机溶剂。同时对各提取法得到的PAC抗氧化活性进行了比较，发现Ch-M55提取的PAC抗氧化活性与70 %丙酮提取的PAC相近，但略低于70 %甲醇和70 %丙酮提取的PAC。这可能是由于各溶剂提取的PAC聚合度不同。但考虑到生物降解性和毒性，基于Ch-M55的提取方法更高效、绿色、环保，可为从银杏叶中提取PAC提供参考。此外，PAC非常不稳定，其核心黄酮阳离子结构对热、光照、氧化和酶胁迫敏感性较高，加热即会导致其共价键断裂。而DES中PAC稳定性明显提高。Dai等[26]研究表明，与传统溶剂水、40 %乙醇等相比，NADES能提高花色苷在高温、光照等条件下的稳定性，NADES含水量越高，黏度越低，花色苷的稳定性越好。这可能与花色苷与溶剂之间的强氢键作用有关。

除了传统的超声辅助低共熔溶剂提取法（DES-UAE）、DES-MAE等，研究人员还将一些新技术作为辅助以提高DES对天然产物的提取能力，如超高压提取（UPE）[9]、负压空化萃取（NPCE）、高速均质化法（HSH）等。

3.2 DES在木质素类化合物提取中的应用

木质素是一种多酚类大分子物质，由于其分子量大、分子内和分子间具有氢键网络、芳香集团pi-pi的堆积作用等，结构非常紧凑，因此溶解木质素较为困难。从植物原料中分离木质素常用两种方法：其一是将原料中除木质素之外的组分溶解并除去，过滤分离得到木质素；其二是将木质素溶解，过滤除去纤维素等不溶性组分。目前DES提取木质素类物质多采用第一种方法[27]。Malaeke等[28]运用DES对木质素、纤维素和木聚糖的溶解能力进行了研究，发现所有DES都表现出良好的木质素溶解能力，在氯化胆碱-间苯二酚DES中溶解度高达48.15 %（w/w），为目前木质纤维素生物聚合物在溶剂中能达到的最大溶解度，而纤维素和半纤维素的溶解度均明显低于木质素。该研究指出，这是由于DES中氯化胆碱等具有易于接受氢键的性质，能克服木质素分子间和分子内的相互作用，提高溶液中组分的迁移率和扩散率。而氢键供体，羟基和苯基都能与木质素低聚糖相互作用，起到增溶效果。Song等[29]建立了一种基于DES处理和连续有机溶剂分离的温和条件下通过酸解和疏水作用从白杨中分离木质素的有效方法。采用DES提取预处理过的白杨样品后依次用乙酸乙酯、乙醇、丙酮、二烷/水（95:5）进行萃取，有效去除了以糖类衍生物为主的杂质。该方法能分离出具有可调节键、基团和各种结构特征的木质素组分，并在木质素的分离、改性和解聚中起到重要作用。

同时DES的pH对木质素的分离效果也有一定的影响，且该影响与传统的酸性或碱性溶剂相似。Tan等[30]用6种pH不同的DES对油棕榈果串进行了一步分馏处理，并对pH值和官能团变化对脱木质素效率的影响进行了评估。用水对油棕榈果串进行提取后乙醇萃取24 h，得到的油棕榈果提取物与DES（10 %，w/w）在120 ℃油浴条件下充分混合提取8 h。发现摩尔比为1:5的氯化胆碱-乳酸组成的DES（pH 0～1）表现出了良好脱木质素效果，木质素的去除率为88 %。同时，与传统酸水解的原理不同，酸性DES对木质素的解离作用主要靠HBD和HBA之间的氢键，且酸性DES分离木质素的效率多优于传统的酸水解。

3.3 DES在酚类化合物提取中的应用

酚类化合物是一种来源广泛的优秀的天然抗氧化剂，具有调节免疫、预防心血管疾病、修复肝损伤、预防癌症等药理活性[31-33]。Wei等[34]用14种DES对木豆叶中极性不同的14种酚类进行提取，发现由氯化胆碱和麦芽糖组成的DES对不同极性化合物的萃取范围较宽，对14种酚类物质的总提取率高，且优于常规溶剂。优化条件如下：氯化胆碱-麦芽糖（摩尔比1:2），含水量20 %，萃取温度60 ℃，料液比30:1 ml/g，微波时间12 min。另外，采用主成分分析对不同提取溶剂和目标化合物提取效率的相关性进行了研究，发现氯化胆碱和乳酸制备的DES和80 %乙醇对其中的弱极性酚类提取效率最优。

通过改变组成DES的溶剂种类和比例，能实现对目标化合物的选择性提取。Wang等[35]建立了一种利用DES从无花果中同时提取补骨脂素（PSL）、补骨脂酸葡萄糖苷（PAG）、芦丁（RT）、咖啡基苹果酸（CMA）、香柑内酯（BET）5种活性成分的方法。该研究发现，氯化胆碱-甘油组成的DES对CMA和PAG的提取率最高，氯化胆碱-木糖醇对RT的提取率最高，而氯化胆碱-果糖对BET的提取率最高，甘油、木糖醇和果糖组成的DES可能对目标化合物均有较好的提取能力。最终优化得到的提取率最高的DES由甘油、木糖醇、D-果糖（摩尔比3:3:3）组成，与传统提取溶剂甲醇相比，能同时提高5个目标化合物的提取率。该研究为利用DES的选择性提高酚类的提取效率提供了一定参考。

Chanioti等[36]采用DES，并联合使用高速均质化法（HAE）、微波提取法（MAE）、超声提取法（UAE）和高静水压提取法（HHPAE）等较为创新的辅助提取方法对橄榄果渣中总酚进行提取，并对橄榄果渣中总酚含量、抗氧化活性和单个酚类化合物的提取效率的相关性进行了研究。发现NADES对提取物的抗氧化活性有显著影响，在均质速度12 000 r/min、温度60 ℃条件下，提取物抗氧化活性以IC50计可达5.11±0.85 g（提取物）/g（DPPH）。且与传统溶剂（70 %乙醇）相比，研究中多数DES都能显著提高酚类化合物的提取效率，为大规模回收橄榄果渣中酚类化合物提供了一种快速高效的选择。

DES提取法在食品和保健品领域也有潜在的应用前景。阮怿航等[37]运用乳酸-甜菜碱（摩尔比2:1）制备的DES成功提取了铁观音中乌龙茶中的多酚类主要成分，主要包括儿茶素（C）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）等。以儿茶素的提取为响应值进行Box-Behnken分析，优化得到最优的提取条件为：提取时间40 min、提取温度60 ℃、DES含水量32 %。并对儿茶素提取物进行高效液相色谱（HPLC）分析，发现提取物中主要成分为EGCG和EGC，占总量的69.2 %，由此推断儿茶素中具有保健功效的成分主要为EGCG和EGC。

3.4 DES在生物碱提取中的应用

生物碱是自然界中一类含氮的碱性有机化合物，大多具有重要的生物活性，如抗糖尿病、抗抑郁抗焦虑、抗内毒素、抗炎、抗氧化等[38-41]。目前有研究人员将DES运用到生物碱的提取分离中，发现这种新型溶剂比传统溶剂有更高的提取效率。Takla等[42]开发了以非离子表面活性剂和天然DES为绿色提取溶剂，以石蒜碱、龙葵碱、龙葵胺为标记化合物，从鲍氏文殊兰中提取生物碱的方法。非离子表面活性剂Genapol X-80的提取率为138 %，149 %和145 %；氯化胆碱-果糖组成的DES作为提取溶剂时提取效率最高，分别为243 %，225 %和238 %，且研究中多数DES对生物碱的提取能力均高于传统溶剂（甲醇、乙醇和水）。尚宪超等[43]也对DES提取烟草中生物碱的方法进行了优化，在DES含水量32 %、提取温度40 ℃、料液比10 mg/ml、提取时间30 min时烟碱得率最高，为22.72 mg/g，为烟碱的绿色提取提供技术参考，结果也表明胆碱类DES是一种优良的生物碱提取溶剂。

同时，DES可作为新型流动相添加剂，大大提高生物碱的色谱纯化效率，使生物碱的峰尾减少、分辨率提高，分离效果明显改善。Tan等[44]以乙腈和1.0 % DES水溶液（pH 3.3）为流动相，显著提高C18柱上氯化鱼腥草碱、氯化小檗碱、白屈菜碱等季铵盐的分离度。

3.5 DES在多糖类提取中的应用

多糖是由10个以上的单糖分子通过糖苷键相连组成的天然高分子化合物，分为同多糖和杂多糖。多糖具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力、维持人体机能、抗肿瘤、抗菌消炎、抗病毒等药理活性[45]。Gao等[46]采用环氧乙烷-环氧丙烷共聚物（EOPO）和DES的热分离水性两相体系，对山茶籽中的多糖进行提取。首先使用DES进行粗提，并对提取温度、时间、pH值等进行优化，在最佳条件下获得了152.37 mg/g的最大提取收率。之后采用EOPO/DES 双水相体系对多糖进行纯化，分离富EOPO上相，最后于水浴中进行温度诱导的相分离，两次萃取后多糖的最大回收率为84.92 %。

黄秀红等[47]使用6种DES对乌龙茶中的多糖进行提取，发现甜菜碱和1, 3-丁二醇组成的DES对茶多糖提取效率最高，可达6.91 %。且与常规水提法相比，该法提取的茶多糖得率、羟基自由基清除能力和DPPH自由基抗氧化能力分别提高了20.22 %，32.65 %和53.79 %。因此DES提取的茶多糖具有较强的抗氧化活性，且该方法具有绿色环保高效的优势，对茶多糖的提取和应用具有重要意义。

3.6 DES在挥发油提取中的应用

挥发油是一类具有挥发性的芳香类油状液体物质，在大多科属植物中均有分布，在松柏科、樟科、兰科、芸香科等植物中分布较为丰富[48]。挥发油常由萜类、脂类、醛类、酮类、醇类多种化学成分混合组成，多具有抗癌、抗菌、抗病毒等药理活性。目前挥发油的提取方法主要有水蒸馏法（HD）、超临界萃取法（SFE）、微波辅助萃取（MAE）等，其中最常用的方法为水蒸馏法[49]。Zhao等[50]建立了一种微波辅助天然DES预处理与微波加水蒸馏法相结合（MA-NADES-MHD）从小茴香种子中高效提取挥发油类成分的方法。将小茴香粉末和NADES进行微波处理4 min后，加入去离子水微波处理5 min；最后通过水蒸馏对挥发油组分进行提纯。提取后使用气相色谱-质谱联用（GCMS）对各挥发油提取物进行测定，将NADES提取与微波辅助提取法（MHD）、超声辅助微波加水蒸馏提取法（UA-NADES-MHD）进行了比较，分别鉴定出58，45，48种挥发性成分，表明使用NADES提取得到的挥发性成分种类更多。整体耗能和对环境的影响方面，MA-NADES-MHD能有效降低提取成本，且NADES大大提高了挥发油的提取效率。

Jeong等[51]提出了一种运用DES一步制备薄荷中挥发性组分的新方法。用氯化胆碱-葡萄糖（摩尔比5:2）组成的DES从薄荷中提取得到的挥发性单萜和酚类含量可达检测水平，直接用于后续各项分析，避免了传统分析中耗时的样品制备步骤。

樊志国等[52]基于超声辅助提取法、运用氯化胆碱-尿素组成的DES，对胡椒叶中挥发油成分进行提取，并以挥发油得率为响应值，运用单因素试验和Box-Behnken试验设计进行优化：液料比14 ml/g，超声功率300 W，蒸馏时间53 min，挥发油得率最高达1.380 %±0.018 %。该方法为胡椒叶挥发油的开发利用提供了一种新的提取方法。

4 总结与展望

DES作为一种具有普遍适用性的活性成分提取溶剂，具有价廉易得、无毒环保、易于制备、可生物降解等优点，应用前景广阔。目前DES多用于黄酮类、木质素类、酚类、生物碱类、多糖类、精油类化合物的提取，然而由于其挥发性低，提取后与活性组分的分离较为困难，因此仍需对提取液做进一步处理，如双水相萃取、大孔树脂萃取等。与此同时，DES分离的机制尚不十分明确，DES与目标化合物之间的相互作用等仍待进一步研究发现。