基于一测多评法对小儿解感颗粒中5个成分的质量控制

江玉娟，潘瑞雪，周黎明，李 琳，贾美春*

（1.山东明仁福瑞达制药股份有限公司 山东省骨科疼痛类工程技术研究中心，山东 济南 250104；2.山东省食品药品审评认证中心，山东 济南 250014）

小儿解感颗粒由大青叶、柴胡、黄芩、荆芥、桔梗、甘草6味中药组成，具有解热解表，消炎止咳的功效，用于感冒发烧，头痛鼻塞，咳嗽喷嚏，咽喉肿痛[1]。全方功用为清热解毒，宣散郁热，宣肺解表。临床主要用于小儿外感发热、咽喉肿痛，且用于小儿手足口病疗效甚佳[2]。处方中黄芩、甘草的主要活性成分为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷、甘草酸铵。小儿解感颗粒的相关文献研究主要集中在采用高效液相色谱（HPLC）测定单一药材的单一成分含量，未见一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）对小儿解感颗粒的质量控制相关文献[3-4]。

QAMS是采用药材（或成药）中的某一有效成分作为内参物，建立内参物与其他待测成分间的相对校正因子（f），利用f测定其他成分含量的方法，该方法适用于对照品难得或制备成本高等情况下多成分的同时测定[5-7]，应用于中药材、中药饮片、中成药等同类型或不同类型多种成分指标的测定，为中药的质量提供保障[8-20]。

本研究以黄芩苷为内参物，建立黄芩苷与其他4个成分的f，利用f计算小儿解感颗粒中汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷的含量，并与外标法进行比较，验证QAMS法的准确性与可行性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括四元高压溶剂系统、自动进样器样品管理器、二极管阵列检测器（美国安捷伦）；Waters e2695高效液相色谱仪，包括四元高压溶剂系统、自动进样器样品管理器、二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站（美国沃特世）；色谱柱：SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、YMC C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Mettler XPE205型十万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多），Sartorius MSA6.6S-CE型百万分之一分析天平（德国赛多利斯）；SK250HP超声仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量95.4 %），汉黄芩苷对照品（批号：112002-201702，含量 98.5 %），甘草苷对照品（批号：111610-201607，含量 93.1 %），黄芩素对照品（批号：111595-201808，含量 97.9 %），汉黄芩素对照品（批号：111514-201706，含量100 %，中国食品药品检定研究院）；小儿解感颗粒（规格：每袋1.0 g，山东明仁福瑞达制药股份有限公司，批号：18105084，18105080，18105083，18112401，18112701，18112901，20190128，20190129，20190130，19105028，19105029，19105030）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷对照品适量，加70 %甲醇溶解，制得质量浓度为分别为452.768，93.496，66.885，52.378，264.21 µg/ml的混合对照品储备液。精密量取对照品储备液5 ml，加甲醇配制成黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷浓度分别为226.384，46.748，33.442，26.189，132.105 µg/ml的混合对照品溶液，备用。分别精密称取黄芩苷，汉黄芩苷，黄芩素，汉黄芩素，甘草苷对照品适量，加70 %甲醇溶解，制得质量浓度分别为580.79，128.247，66.8852，67.551，210.0336 µg/ml的单一对照品储备液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取小儿解感颗粒约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇溶液25 ml，称量，超声（功率250 W，频率53 kHz）处理30 min，再称量，用70 %甲醇溶液补足减失的量，滤过。精密量取续滤液1 ml，置10 ml量瓶中，用70 %甲醇溶液稀释并定容至刻度，过0.22 µm微孔滤膜，备用。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按小儿解感颗粒工艺方法，制备缺黄芩和甘草药材的阴性样品，按2.1.2项下方法处理并制备溶液，即得。

2.2 色谱条件

以Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1 %磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，12 %A→27 %A；20～40 min，27 %A→50 %A；40～43 min，50 %A；43～44 min，50 %A→12 %A；44～55 min，12 %A）；流速：1.0 ml/min；检测波长274 nm；柱温30 ℃。在上述色谱条件下，5个成分分离度均大于1.5。混合对照品溶液图谱、供试品溶液的色谱图见图1。

图 1 阴性样品溶液（A）、混合对照品溶液（B）、供试品溶液（C）HPLC图谱

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各20 µl，进样分析。结果显示，供试品溶液中各待测成分色谱峰分离度较好，阴性样品溶液在相应位置处无干扰。

2.3.2 定量限考察 分别取单一对照品储备液进行逐步稀释，分别精密量取稀释后溶液10 µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察各成分的定量限。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷的定量限分别为0.102，0.067，0.154，0.054，0.272 μg/ml。

2.3.3 线性关系考察 按2.2项色谱条件，分别精密吸取混合对照品贮备液1，3，5，7，9 ml，加甲醇稀释至10 ml，分别精密量取系列混合对照品溶液与 2.3.2项下定量限溶液10 µl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。结果见表1。

表1 5个成分线性关系考察结果

2.3.4 精密度试验 取2.3.3项下的同一混合对照品溶液，连续进样6针，记录各组分色谱峰峰面积并计算RSD，结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷峰面积的RSD分别为0.46 %，0.64 %，0.45 %，0.49 %，0.48 %，表明仪器精密度良好。

2.3.5 溶液稳定性试验 精密称取6个对照品适量，加适量甲醇溶解并制备成相应浓度的混合对照品溶液；取样品（批号：20190128），按2.1.2项下方法制备供试品溶液。于制备后0，2，4，6，8，12，24 h，分别取混合对照品和供试品溶液，注入液相色谱仪，分别计算各组分色谱峰峰面积的RSD。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷对照品峰面积的RSD分别为1.24 %，1.35 %，1.24 %，0.87 %，1.02 %，样品各成分峰面积的RSD分别为0.84 %，0.62 %，1.36 %，1.20 %，1.36 %，表明各组分在24 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 取样品（批号：20190128），按2.1.2项下方法制备6份供试品溶液，测定并计算各成分的含量。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷的含量平均值分别为167.99，30.71，2.45，1.97，2.33 μg/g，RSD分别为0.80 %，1.00 %，1.84 %，1.46 %，1.76 %，表明该方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 取已知含量（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷的含量分别为167.99，30.71，2.45，1.97，2.33 μg/g）的小儿解感颗粒（批号：20190128）共6份，每份0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入单一对照品贮备液适量（分别相当于0.25 g供试品中对应成分含量的50 %，100 %，150 %），按2.1.2项下方法制备供试品溶液，测定并计算各成分的回收率。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷的平均加样回收率（n=6）分别为99.16 %，100.54 %，98.02 %，97.84 %，98.78 %，RSD分别为0.69 %，2.46 %，1.94 %，2.08 %，1.90 %，表明该方法的准确度良好。

2.4 ƒ值的测定

2.4.1f值的测定和计算 采用Agilent 1260型高效液相色谱仪和Waters Sun Fire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。精密吸取2.1.1项下各浓度的混合对照品溶液20 µl，注入液相色谱仪，按2.2项下色谱条件测定，记录相应的色谱峰面积。以黄芩苷为内参物，按下式计算汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷的f值。

式中：Ak为内参物峰面积，Wk为内参物浓度，As为某待测成分峰面积，Ws为待测成分浓度，结果见表2。

表2 以黄芩苷为内参物的4个成分的ƒ值

2.4.2 不同仪器对ƒ的影响 本试验考察了2台不同厂家液相色谱仪Agilent 1260（1）、Waters e2695（2）和3个色谱柱[SunFire C18（A）、ZORBAX C18（B）、YMC C18（C）]对ƒ的影响，结果4个成分ƒ的RSD分别为1.94 %，1.52 %，1.76 %，1.57 %，表明不同仪器、不同色谱柱对各成分的ƒ无显著影响，结果见表3。

表3 不同仪器、不同色谱柱对ƒ的影响

2.4.3 柱温对ƒ值的影响 本试验考察了柱温（27，30，33 ℃）对ƒ值的影响，结果4个成分ƒ值的RSD分别为1.36 %，1.18 %，1.91 %，0.68 %，表明柱温在27～33 ℃之间对各成分的ƒ值无显著影响，结果见表4。

表4 不同柱温对ƒ值的影响

根据以上考察结果，最终确定汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷的ƒ值分别为0.823，0.674，0.549，1.873。

2.5 QAMS与外标法测定结果的比较

取12批样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积，采用外标法对4个成分及黄芩苷进行定量测定，再用所建立的QAMS法进行定量计算，以验证QAMS法用于小儿解感颗粒中多指标评价的准确性，结果见表5。2种方法测得的各成分含量无明显差异，表明建立的方法准确性较好。

表5 QAMS与外标法测定小儿解感颗粒中5个成分的结果对比

3 讨论

3.1 指标成分的选择

小儿解感颗粒处方中主要成分包括大青叶、柴胡、荆芥、黄芩、桔梗、甘草。本研究先后对柴胡、甘草、黄芩、桔梗的主要组分进行HPLC测定，考察最大波长吸收、峰形、分离度等指标，确定建立黄芩苷、汉黄芩苷、甘草苷、黄芩素、汉黄芩素5个指标性成分。

3.2 内参物的选择

本试验曾先后选择黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷作为内参物，建立QAMS法计算各成分的量，计算结果与外标法进行比较，结果表明：以黄芩苷作为内参物的相对偏差波动范围小，故选择含量高、对照品易得的黄芩苷作为内参物。

3.3 关于色谱条件

3.3.1 检测波长的选择 采用高效液相色谱仪PDA检测器，进行190～400 nm全波长扫描，结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷均在274 nm波长处有较大吸收，结合5个成分3D色谱图，最终确定274 nm作为检测波长。

3.3.2 分离条件的优化 在查阅相关文献基础上，以分离度、峰形、峰高等作为考察指标，采用HPLC梯度洗脱，考察不同流动相（乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.2 %磷酸）体系的分离效果，确定以乙腈-0.1 %磷酸为流动相，并对洗脱条件进行优化，达到较好的分离效果，且重复性、精密度等方法学考察均符合要求。

3.4 QAMS中色谱峰的定位

QAMS方法的建立需要对待测成分的色谱峰进行准确定位，本试验分别采用保留时间差和相对保留时间法进行峰定位，结果显示：采用保留时间差法进行峰定位，部分待测成分与黄芩苷保留时间差在不同色谱柱上RSD大于5 %；采用相对保留时间法进行峰定位，各待测成分与黄芩苷相对保留时间的RSD均在5 %以内，表明采用相对保留时间法进行峰定位效果良好。

3.5 QAMS的耐用性考察

本试验考察了2台液相色谱仪（Agilent1260，Waters e2695），3个色谱柱[SunFire C18（A）、ZORBAX C18（B）、YMC C18（C）]和不同柱温对f的影响，结果显示5个成分f的RSD均小于3 %，表明该方法耐用性良好。

4 结论

QAMS方法的建立可有效地解决在对照品紧缺或昂贵的情况下，实现对多组分样品的定量分析和质量控制，具有低成本、高效、便捷等优点。本研究建立的QAMS法测定小儿解感颗粒中5个组分，以黄芩苷为内参物，建立其他待测组分与黄芩苷之间的相对校正因子，计算各待测组分的含量，并与外标法作比较，计算结果无显著差异。本研究建立的QAMS法为小儿解感颗粒的质控和定量分析提供新的思路和方法。