柱前衍生-高效液相色谱法测定酒中的氰化物

何维为，徐灿辉，何 超，孙诗程

（益阳市食品药品检验所，湖南 益阳 413000）

氰化物是指带有氰基的化合物，可分为无机氰化物和有机氰化物，凡能在热或与酸作用后在空气中或组织中释放出氰离子或氢氰酸的均有剧烈毒性。氰化物通常以氰苷配糖体的形式广泛存在于多种植物中。据统计，含氰化物的植物超过2000种，其中果核类有1000余种，如木薯、高粱、小麦、玉米、杨梅、亚麻籽、葡萄籽等[1-2]。如果采用含氰化物的植物为原料制酒，产品中可能带入氰化物，一旦超出限量即可危害人体健康，造成公共安全事件[3-4]。目前，国家安全标准规定白酒中的氰化物含量限度为≤0.8 mg/L[5]。测定方法主要是国家标准[6]第一法：异烟酸-吡唑啉酮分光光度法。然而，此法对反应体系的pH值要求较严（6.7～6.9），在实际操作时，常因反复调节pH值使溶液总体积超出标准限度，导致回收率低甚至试验失败；有一些澄清的酒类加入显色剂后也会产生轻微浑浊，影响吸光度测定[7-8]。因此，化学滴定法、连续流动分析仪测定法、离子色谱法、顶空气相色谱法、气相-质谱联用法等也被广泛研究[9-13]，但高效液相色谱法未见研究报道。本文通过采用异烟酸-巴比妥酸柱前衍生，建立酒中氰化物的高效液相色谱测定法，检测白酒、啤酒、葡萄酒等不同种类的酒中氰化物，获得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；甲醇，乙腈（色谱纯，Honeywell）；水中氰标准溶液[来源：中国计量科学研究院 GBW（E）080115，批号：19045，浓度：50.0 mg/L]；异烟酸（分析纯，国药集团）；巴比妥酸（分析纯，国药集团）；氯胺T（分析纯，国药集团）；水为超纯水。样品均由市场购得。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，菲罗门），流动相：1 %乙酸-乙腈（50:50）。检测波长600 nm，流速1.0 ml/min；柱箱温度25 ℃；进样体积20 μl。

1.2.2 溶液制备 磷酸盐缓冲液（pH 5.0）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.9 g，加水溶解，并稀释至100 ml，用磷酸调节pH至5.0，即得。

异烟酸-巴比妥酸试液：称取异烟酸2.0 g和巴比妥酸1.0 g，加到100 ml 60～70 ℃的12 g/L氢氧化钠溶液中，搅拌溶解，冷却后加水至100 ml，即得。

氯胺T溶液：称取氯胺T1.0 g，加水100 ml，搅拌溶解，即得。

白酒样品溶液：吸取1.0 ml试样，置入50 ml烧杯，加入2 g/L氢氧化钠溶液5 ml，放置10 min，然后放于120 ℃电加热板上加热至溶液剩余约1 ml，取下放至室温，用2 g/L氢氧化钠溶液转移至25 ml具塞比色管中，最后加2 g/L氢氧化钠至10 ml。

有色酒样品溶液：取25.0 ml试样于250 ml蒸馏瓶中，加入100 ml水，滴加甲基橙指示剂数滴，将冷凝管下端插入盛有2 g/L氢氧化钠溶液的10 ml比色管液面下，再加入1.5 g酒石酸，迅速连接蒸馏装置进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约50 ml，然后用水定容至 50 ml，混合均匀。取馏出液2.0 ml，按白酒样品溶液制备方法制备。

标准曲线溶液：精密吸取水中氰标准溶液（50.0 mg/L）2.00 ml，置入100 ml量瓶中，加水稀释至刻度（1.0 mg/L），再分别精密吸取稀释溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氢氧化钠至10 ml。

空白溶液：用水25.0 ml作为样品，照有色酒样品溶液制备方法制备。

加标样品溶液：取按本文方法测定结果为未检出的样品（见表2干红葡萄酒）25.0 ml，精密加入1.0 mg/L氰标准溶液，按有色酒样品溶液制备方法制备。

1.2.3 测定法 取样品溶液和系列标准溶液，分别加入2滴酚酞指示剂，然后逐滴加入3 %乙酸溶液调至红色刚好褪去，加磷酸盐缓冲液（pH 5.0）3.0 ml，再加入氯胺T溶液0.25 ml，摇匀，放置3 min，加入异烟酸-巴比妥酸试液5.0 ml，加水稀释至 25 ml，密塞，25 ℃恒温水浴锅中放置15 min，用0.45 μm滤膜过滤。取续滤液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积外标法计算含量。

2 结果与分析

2.1 方法学研究

2.1.1 异烟酸-巴比妥酸试液的用量 吸取氰标准溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氢氧化钠至10 ml，按1.2.3 项方法，通过测定加入不同体积异烟酸-巴比妥酸试液反应的衍生物峰面积变化，考察衍生试剂用量的影响。如图1所示，随着试剂用量增加，峰面积增大，在加入量5.0 ml时达到稳定。

图1 衍生剂加入量对峰面积的影响

2.1.2 反应体系酸碱度 吸取氰标准溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氢氧化钠至10 ml，按1.2.3项方法，通过分别加入不同pH值的磷酸盐缓冲液3 ml控制反应体系酸碱度，测定其衍生物峰面积变化来考察酸碱度对反应的影响。如图2所示，反应体系在pH 5.0～6.0范围内较稳定，加入pH 5.0磷酸盐缓冲液时峰面积最大。

图2 pH值对峰面积的影响

2.1.3 反应温度和反应时间 吸取氰标准溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氢氧化钠至10 ml，按1.2.3 项方法，通过测定改变反应时间和温度条件下衍生物的峰面积变化考察反应温度和反应时间的影响，结果表明，反应体系超过30 ℃时峰面积明显降低，低于20 ℃反应速率降低，反应时间长且反应不完全，采用25 ℃反应15 min即可达到稳定。

2.1.4 检测波长确定 吸取氰标准溶液（1.0 mg/L）1.00 ml于25 ml具塞比色管中，加 2 g/L氢氧化钠至10 ml，按1.2.3项方法衍生显色，在200～800 nm范围内进行紫外-可见吸收光谱扫描，溶液在600 nm和250 nm有最大吸收，250 nm吸光度虽更强，但属于紫外吸收区，干扰因素多，故选取专属性强的600 nm为检测波长。

2.1.5 流动相选择 本文分别考察水与甲醇、水与乙腈、1 %乙酸与甲醇、1 %乙酸与乙腈作为流动相的分离效果。结果表明，水与甲醇作为流动相时色谱峰出现双峰，水与乙腈作为流动相时色谱峰拖尾严重，1 %乙酸与甲醇作为流动相时呈现“馒头峰”，1 %乙酸与乙腈作为流动相时峰对称性好、理论板数高。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性 取空白溶液、标准溶液、阴性样品溶液（未检出）、加标样品溶液分别注入色谱仪，记录色谱图（见图3）。结果表明：空白溶液在标准溶液色谱主峰的保留时间无色谱峰，样品溶液中无干扰目标物检测的色谱峰。

图3 专属性试验色谱图

2.2.2 线性和范围 取系列标准溶液分别注入色谱仪，记录色谱图，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得线性回归方程：Y=6.1885X+0.4019，r2=0.9998，在0.5～40.0 μg/L范围内目标物浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.3 精密度 取加标样品溶液（约含氰化物20.0 μg/L）连续进样6次，记录色谱图，峰面积分别为：124.035，123.158，124.593，123.268，123.997，124.691，相对标准偏差（RSD）为0.41 %，表明本法精密度良好。

2.2.4 稳定性 取加标样品溶液（约含氰化物20.0 μg/L）每隔1 h进样1次，共8次，记录色谱图，峰面积分别为：123.614，124.635，125.158，122.589，124.156，122.463，123.561，121.653，RSD为0.76 %，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.2.5 检出限 通过逐渐减小氰标准溶液加入体积来制备不同浓度的标准溶液，按照1.2.3项方法衍生并取滤液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以S/N=3计算，检出限为0.5 μg/L。

2.2.6 加标回收率 取按2.2.7项测定氰化物含量的3种类型的样品，分别加入一定体积的氰标准溶液（1.0 mg/L），按1.2.2项方法制备供试溶液。按低、中、高3个浓度水平加标，每个加标浓度水平制备3份，按本法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 3种类型酒回收率测定结果（n=9）

2.2.7 样品测定 取白酒、啤酒、葡萄酒各2批，每批样品制备5份待测溶液，按本法测定氰化物含量，结果见表2。

表2 3种类型酒样品测定结果（n=5）

3 讨论

该方法测定原理为在碱性条件下加热除去酒中高沸点有机物，然后在pH 5.0条件下，用氯胺T将氰化物转变为氯化氰，再与异烟酸发生戊二烯醛反应，其产物能与巴比妥酸生成蓝色染料，再经高效液相色谱分离后以峰面积外标法计算含量。与现行的国家标准异烟酸-吡唑啉酮分光光度法[6]对比，如表3所示，采用异烟酸-巴比妥酸作为衍生试剂可在更宽的pH值范围内较快达到反应稳定，简化了操作；通过HPLC分离后测定，可提高方法的灵敏度、准确度，也有更好的样品适应性。

表3 2种方法比较结果

4 结论

本文采用异烟酸-巴比妥酸为柱前衍生试剂，建立了HPLC测定酒中氰化物方法。结果表明，此法准确可靠、灵敏度高、稳定性好，有较好的样品适用性，可为酒中氰化物测定的标准提升提供参考。