巴克夏猪、霍寿黑猪及其杂交后代ESR 基因和FSHβ 基因多态性的检测

许金根，靳二辉，顾有方，王重龙，李庆岗*

（1.安徽科技学院动物科学学院，动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽凤阳 233100；2.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥 230031）

繁殖性状是猪重要的经济性状，对其遗传改良可明显提高产仔数和经济效益。在当前由非洲猪瘟疫情导致国内猪存栏量下降的背景下，提高产仔数对我国生猪产能恢复有积极意义。但猪的产仔数属于低遗传力性状，通过常规育种措施遗传进展缓慢，可利用分子标记辅助选择加速猪繁殖性状的改良进程。雌激素受体（Estrogen Receptor，ESR）通过与雌激素结合而影响雌性动物的生殖力、繁殖周期、胚胎发育等[1]。卵泡刺激素（Follicle-stimulating Hormone，FSH）具有促进动物颗粒细胞增生和卵泡液分泌，以及促进雌激素合成与分泌等作用，由α和β亚基构成，其生物学特异性由β亚基决定[2]。因此，ESR和FSHβ被认为是调控猪产仔数的重要功能候选基因。研究发现，ESR基因的PvuII多态位点与中外猪种（如：太湖猪、大白猪）的繁殖性状相关[3-4]，FSHβ基因的多态性与猪产仔数相关[5]。另外，也有研究者联合分析ESR基因和FSHβ基因对不同猪种繁殖性状的影响[6-7]。巴克夏猪是肉质优良的国外瘦肉型猪种，属毛色呈六端白的黑猪，与我国地方黑猪杂交可以生产兼有地方猪种风味和适度瘦肉率的精品黑猪[8]。霍寿黑猪属于淮猪的一个类群，具有繁殖力高、肉质优良、适应性强等特点，可用于纯种或与巴克夏猪杂交生产优质黑猪肉[9]。国内外研究者已对猪ESR基因和FSHβ基因多态性进行大量检测，主要集中于国外的杜洛克猪、长白猪、大白猪以及我国多个地方猪种，但对巴克夏猪和霍寿黑猪的研究较少。我国地方猪种的产仔数一般高于国外引进猪种，是研究猪繁殖性能的宝贵实验材料。通过比较中外猪种繁殖性状候选基因多态性的分布特征，不仅为解析两者繁殖性能的遗传差异提供理论依据，还能为开发分子标记用于我国地方猪种及其杂交群体产仔数的辅助选择积累基础资料。因此，本实验通过检测巴克夏猪、霍寿黑猪及其杂交后代ESR基因和FSHβ基因多态性，并研究这2 个基因多态性在不同猪群中的分布差异，为寻找提高猪繁殖性能的分子遗传标记奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 采集32 头巴克夏猪、48 头霍寿黑猪和105 头杂交后代（巴克夏猪♂× 霍寿黑猪♀）的耳组织样本，保存于75%酒精。

1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker 购自北京天根生化科技有限公司，限制性内切酶PvuII 购自NEB 公司。主要仪器：核酸蛋白浓度测定仪（美国Thermo Fisher 公司）、梯度PCR 仪（德国Eppendorf 公司）、凝胶电泳成像系统（美国Bio-Rad公司）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 基因组DNA 的提取 采用常规酚/ 氯仿法提取猪基因组DNA，用紫外分光光度计测定浓度后，将其稀释到100 ng/μL，于4℃保存待用。

1.4 PCR 扩增 猪ESR基因扩增引物参照Short 等[10]设计、FSHβ基因扩增引物参照赵要风等[5]设计，具体序列见表1。

表1 猪ESR 基因和FSHβ 基因PCR 扩增引物

PCR 反应体系：1 μL DNA，10 μL 2×Taq PCR Μaster Mix，上、下游引物各1 μL（10 mmol/mL），加ddH2O至终体积20 μL。PCR 扩增程序：95℃预变性4 min；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃终延伸8 min。

1.5 基因多态性检测 猪ESR基因的PCR产物酶切体系共10 μL：PCR 产物5 μL，限制性内切酶PvuII（10 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 1 μL，ddH2O 3.5 μL。37℃酶切4 h 后，经3%琼脂糖凝胶电泳检测进行分型。猪FSHβ基因多态性由片段插入形成，PCR 产物直接经2%琼脂糖凝胶电泳检测分型。

1.6 统计分析 用Popgene 32 软件统计猪ESR、FSHβ的基因频率、基因型频率，以及遗传多态性指标。

2 结果

2.1 猪ESR基因和FSHβ基因多态性检测结果 猪ESR基因PCR 扩增产物经PvuII 酶切后，产生等位基因A（120 bp）和B（55、65 bp），并检测到AA、AB 和BB 基因型（图1）。猪FSHβ基因经PCR 扩增产生等位基因A（500 bp）和B（220 bp），并检测到AA、AB 和BB 基因型（图2）。

图1 猪ESR 基因PCR 产物Pvu II 酶切检测

图2 猪FSHβ 基因PCR 产物检测

2.2 猪ESR基因多态性的基因型频率和基因频率 如表2 所示，巴克夏猪ESR基因仅检测到AA 型；霍寿黑猪ESR基因检测到3 种基因型，AB 和BB 型频率高于AA 型，等位基因B 频率高于A；巴克夏猪×霍寿黑猪ESR基因检测到3 种基因型，AB 型频率依次高于AA和BB 型，等位基因A 频率高于B。

表2 猪ESR 基因的基因型频率和基因频率

2.3 猪FSHβ基因多态性的基因型频率和基因频率 如表3 所示，巴克夏猪FSHβ基因检测到3 种基因型，BB 型频率依次高于AB 和AA 型，等位基因B 频率高于A；霍寿黑猪FSHβ基因检测到3 种基因型，AB 型频率高于BB 和AA 型，等位基因B 频率略高于A；巴克夏猪× 霍寿黑猪FSHβ基因检测到3 种基因型，AB型频率依次高于BB 和AA 型，等位基因B 频率高于A。

表3 猪FSHβ 基因的基因型频率和基因频率

2.4 猪ESR基因的遗传多态性 如表4 所示，巴克夏猪没有多态；霍寿黑猪的纯合度（0.595 7）高于杂合度（0.404 3），有效等位基因数为1.678 7，SNP 处于中度多态（0.25

表4 猪ESR 基因的遗传多态性

2.5 猪FSHβ基因的遗传多态性 如表5 所示，巴克夏猪的纯合度（0.658 2）高于杂合度（0.341 8），有效等位基因数为1.519 3，SNP 处于中度多态（0.25

表5 猪FSHβ 基因的遗传多态性

3 讨 论

作为调控猪繁殖性状的功能候选基因，ESR基因和FSHβ基因多态性已在国内外多个猪种中进行过检测。本研究首次报道了霍寿黑猪、巴克夏猪×霍寿黑猪ESR基因和FSHβ基因的多态性。

本实验对ESR基因PvuII 酶切位点多态性分析表明，32 头巴克夏猪仅检测到AA 型，可能是因样本量较少导致未检测到AB 和BB 型；48 头霍寿黑猪以AB和BB 型为主，等位基因B 频率较高。兰旅涛等[11]研究发现，国外引进品种杜洛克猪、长白猪、大白猪ESR基因的PvuII 酶切位点都以AA 和AB 型为主，等位基因A 频率较高。李明洲等[3]研究表明，我国地方品种成华猪、内江猪、太湖猪ESR基因的PvuII 酶切位点，均是AB 和BB 型为主，等位基因B 频率较高。曹晶晶等[12]研究发现，ESR基因PvuII 多态位点的基因频率在9 个中外猪种中存在差异，总体上是国外猪种等位基因A 频率占优势，而我国地方猪种等位基因B 频率占优势。本研究表明，ESR基因PvuII 位点国外品种巴克夏猪优势等位基因为A，而地方品种霍寿黑猪优势等位基因为B，这与上述研究结果较一致。同时，本实验发现105 头巴克夏猪×霍寿黑猪ESR基因的AB 和AA型频率高于BB 型，等位基因A 频率高于B，这主要是由于霍寿黑猪导入巴克夏猪血统，提高了等位基因A的频率。另外，ESR基因的PvuII 酶切位点与猪产仔数的Meta 分析表明，猪产仔性状的有利等位基因为B，有利基因型为BB 型[13]。本研究中，巴克夏猪（产仔数低）与霍寿黑猪（产仔数高）ESR基因PvuII 位点基因频率分布存在明显不同，故推测该基因位点对霍寿黑猪的产仔性能有一定影响。本实验结果显示，霍寿黑猪、巴克夏猪× 霍寿黑猪ESR基因PvuII 位点均处于中度多态，表明这2 个猪群该基因位点具有选育潜力。霍寿黑猪是分布在安徽省的优良地方猪种，提高霍寿黑猪的产仔数有助于对其性能进一步开发和利用。巴克夏猪×霍寿黑猪杂交后代除了直接用于商品猪生产，也可以将其留种用于二元母猪生产或以此为基础开展杂交育种培育黑猪新品系。因此，后期可以开展ESR基因与霍寿黑猪、巴克夏猪×霍寿黑猪产仔数的相关性研究，从而提高霍寿黑猪纯种繁育及其与巴克夏猪杂交群体的繁殖性能。

本研究对FSHβ基因多态性分析表明，巴克夏猪、霍寿黑猪、巴克夏猪×霍寿黑猪3 个群体中的FSHβ基因多态性均处于中度多态，且都是AB 和BB 型频率较高，等位基因B 频率较高。苏先敏等[14]研究表明，大白猪、长白猪和杜洛克猪FSHβ基因均是BB 型占优势，等位基因B 占优势。张晓东等[15]研究发现，安庆六白猪、定远猪、皖南黑猪、皖南花猪4 个地方猪种FSHβ基因都以等位基因A 为优势。戴丽荷等[16]研究也表明，除台系杜洛克猪和嵊县花猪外，国外猪种（大约克猪、长白猪、美系杜洛克猪）的等位基因B 频率较高，而地方猪种（金华猪、嘉兴黑猪、八眉猪、巴马香猪）FSHβ基因都是等位基因A 占优势。本实验中，巴克夏猪和霍寿黑猪FSHβ基因频率分布趋势相同，均是等位基因B 频率占优势，巴克夏猪与上述国外引进猪种研究结果相同，但霍寿黑猪与上述地方猪种研究结果不同，这可能是猪种遗传背景差异造成的。赵要风等[5]研究发现，猪FSHβ基因插入产生的多态性，BB 型个体比AA 型平均每胎多产仔1.5 头。甘乾福等[17]研究表明，杜洛克猪、长白猪、大白猪FSHβ基因都以BB 基因型和等位基因B 占优势，但该多态位点对初产和经产母猪的总产仔数无显著影响。因此，FSHβ基因多态性能否用于霍寿黑猪及巴克夏猪×霍寿黑猪群体繁殖性能的选育，有待进一步研究。

综合上述研究结果可见，调控猪产仔数的因素较多，除了ESR基因和FSHβ基因，可能还受其他基因影响[18]。

4 结 论

本实验结果显示，巴克夏猪ESR基因Pvu II位点只检测到AA 型，霍寿黑猪ESR基因检测到3 种基因型，B 为优势等位基因，巴克夏猪× 霍寿黑猪ESR基因检测到3 种基因型，A 为优势等位基因。巴克夏猪、霍寿黑猪、巴克夏猪×霍寿黑猪FSHβ基因均检测到3 种基因型，都是B 为优势等位基因。