枳实黄酮提取物对6-羟基多巴胺所致PC12 细胞 损伤的保护作用

梁曾恩妮，李志坚，单 杨

（湖南省农业科学院，湖南省农产品加工研究所，湖南 长沙 410125）

帕金森病（Parkinson disease，PD）又名震颤麻痹，以静止性震颤、动作迟缓、肌张力痉挛、举止特征异常、眨眼反应以及痴呆等为主要临床表现，是一种发生于老年前或老年期的进行性神经退行性疾病，与中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性坏死等因素有关，尚无有效的根治方法[1]。在65 岁以上的人群中发病率大约为1%～2%，目前全球帕金森病患者约为2 500万人，我国大约有500 万PD 患者[2]。6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）可使神经细胞发生退行性改变、老化和死亡，导致神经末梢损毁，递质减少[3]。PC12 细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞，是氧化胁迫物质的主要靶细胞。6-OHDA 作用PC12 细胞是常用的帕金森病细胞模型[4]。

枳实是芸香科植物酸橙及其变种或甜橙的幼果干燥制成。研究表明，枳实传统功效为破气消积，化痰散痞，临床用于健脾开胃、理气降逆和痰浊阻滞[5]。枳实中最能体现枳实特征的成分是黄酮类化合物，具有抗氧化、消炎、抗癌、抗菌等多种药理学活性[6]。用枳实分离新橙皮苷的同时会产生大量的类黄酮，研究这部分物质的成分、含量和功能，可提高经济效益，为枳实的开发利用增加新的附加产品。

笔者以枳实为原料提取分离枳实黄酮，采用HPLC 法检测总黄酮成分和含量，应用CCK8 法、流式细胞术和蛋白印迹技术等方法研究枳实黄酮提取物对6-OHDA 损伤PC12 细胞的保护作用，为生产橙皮苷后剩余枳实黄酮的利用和进一步防治与衰老有关的神经退行性疾病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枳实由涟源康麓科技生物有限公司提供（经鉴定为酸橙幼果Citrus aurantium L.）；芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素标准品，购于国药集团化工试剂有限公司；橙皮苷、香蜂草苷标准品购于北京索莱宝科技有限公司；色谱级甲醇、二甲基亚砜和乙酸购于美国默克公司；PC12 细胞由中国科学院上海生命科学研究所细胞库提供；胎牛血清购于杭州四季青公司；1640 培养基购于美国Sigma 公司；CCK-8 试剂盒（cell counting Kit-8）购于日本同仁。

主要仪器有IC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）、EL204-IC 型电子天平（美国瑞士梅特勒-托利多公司）、CKX41SF 荧光倒置显微镜（日本Olympus）、MK3 酶 标 仪（美 国Thermo 公 司）、Cytoflex 流式细胞仪（美国Beckman 公司）、水套式Ⅱ型细胞培养箱（美国Thermo 公司）、B-290 喷雾干燥机（瑞士Buchi 公司）、SHB- Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、UV-1700 型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 枳实类黄酮的提取 500 g 枳实粉碎后，加入6倍量的90%乙醇加热回流提取2 次，每次2 h，减压浓缩，采用BA-8 大孔树脂对提取液进行分离，洗脱液浓缩后，用5.0%NaCl 助析，得粗晶，结晶用于获得新橙皮苷。溶液采用DA201-C 大孔树脂脱盐，洗脱液喷雾干燥获得枳实黄酮粉末，称重。

1.2.2 枳实黄酮提取物总黄酮的含量测定 10 种类黄酮标品混溶于10 mL 甲醇和二甲基亚砜（体积比为1 ∶1），超声提取30 min，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，再重复上述操作2 次，合并3 次提取的上清液，10 000 r/min 离心10 min，定容至50 mL，经 0.22 μm 微孔有机滤膜过滤后于HPLC 系统中用C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）进行色谱分离。使用甲醇（A 相）和0.2%乙酸溶液（B 相）双流动相梯度洗脱，洗脱程序为：0～8 min，40%～60%B；8～25 min， 70%～30%B；25～32 min，40%～60%B。流速1 mL/min， 柱温25℃，检测波长设为283 nm。通过混标的保留时间和峰面积，确定样品中类黄酮组成与含量，运用分光光度法测定总黄酮含量。

1.2.3 CCK8 检测细胞活力 PC12 细胞培养于含10%胎牛血清的1640 培养基中，以5×103个细胞/孔密度接种于96 孔板内，每孔100 μL，贴壁后，分别加入不同质量浓度的6-OHDA 和枳实黄酮提取物，各组均设3 个复孔。细胞培养24 h 后，去除培养基，每孔加入100 μL 含有CCK8 的培养基，继续孵育4 h 后于酶标仪分析450 nm 处测定吸光度。

1.2.4 细胞活性氧（ROS）水平检测 PC12 细胞以1.0×105个/mL 密度接种于6 孔板，37℃、5%CO2条件下培养12 h，分别加入50 μM 6-OHDA 和不同质量浓度枳实黄酮提取物（3.75、7.5、15 μg/mL），用无血清培养液稀释DCFH-DA 浓度到10 μmol/L。小心弃去细胞培养液，加入1 mL 的10 μmol/L DCFH-DA，37°C、5% CO2孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，用胰酶消化收集细胞，采用流式细胞仪检测细胞的ROS 水平。

1.2.5 抗氧化酶活性检测 将PC12 细胞以1.0×105个/mL 密度接种于6 孔板中，每孔2 mL，培养12 h贴壁后，分别加入50 μM 6-OHDA 和不同质量浓度枳实黄酮提取物（3.75、7.5、15 μg/mL），吸去细胞培养液后，用pH 值7.4 的PBS 清洗3 次，加入100 μL细胞裂解液，2 000 r/min、4℃离心10 min，保留上清液待测。按试剂盒说明书测定MDA 水平及SOD、CAT、GSH-Px 活力。

1.3 统计学分析

所有数据均以平均值表示。使用SPSS 软件进行单因素方差分析，P ＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 枳实黄酮提取物中总黄酮含量及组成

枳实黄酮提取物得率为12.64%，总黄酮含量35.82%。由图1 可知，枳实黄酮提取物含9 种，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素，其中柚皮苷含量最高，为473.9 g/kg，其次为新橙皮苷（153.7 g/kg）和芸香柚皮苷（59.6 g/kg）。

图1 枳实黄酮提取物总黄酮组成及其含量

2.2 枳实黄酮提取物和6-OHDA 对PC12 细胞活力的影响

与对照组相比，6-OHDA 呈剂量依赖性的抑制PC12 细胞生长（图2）；3.75、7.5、15 μg/mL 枳实黄酮提取物对PC12 细胞生长没有明显影响，但高浓度的枳实黄酮提取物明显抑制PC12 细胞生长（图3）。因此， 3.75、7.5、15 μg/mL 枳实黄酮提取物用于进行后续研究。由图4 可知，3.75、7.5、15 μg/mL 枳实黄酮提取物可显著缓解6-OHDA 对PC12 细胞生长造成的损伤。

图2 6-OHDA 对PC12 细胞活力的影响

[图中不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05），下同]

图3 枳实黄酮提取物对PC12 细胞活力的影响

图4 枳实黄酮提取物对6-OHDA 诱导的PC12 细胞活力的影响

2.3 枳实黄酮提取物和6-OHDA 对PC12 细胞ROS 水平的影响

采用流式细胞术研究了枳实黄酮提取物和6-OHDA 对PC12 细胞ROS 水平的影响。结果（图5）显示，与对照组相比，6-OHDA 能够诱导PC12 细胞内ROS 释放量显著增加；而3.75、7.5、15 μg/mL 枳实黄酮提取物可显著缓解6-OHDA 对PC12 细胞ROS的过度产生。

2.4 枳实黄酮提取物和6-OHDA 对PC12 细胞MDA 和氧化酶活性的影响

图5 枳实黄酮提取物对6-OHDA 诱导的PC12 细胞ROS 水平的影响

如图6 所示，与对照组相比，6-OHDA 组MDA含量显著增加（图4A），SOD、CAT 和GSH-Px 活性显著降低（P ＜0.05）；与模型组（即只添加6-OHDA的处理组）相比，随着枳实黄酮提取物浓度的升高，MDA 含量显著降低，SOD、CAT 和GSH-Px 酶活性均显著增加（P ＜0.05），但7.5 和15 μg/mL 枳实黄酮 对提高6-OHDA 诱导的PC12 细胞抗氧化酶活性没有显著的剂量效应。

图6 枳实黄酮提取物对6-OHDA 诱导的PC12 细胞MDA 含量和抗氧化酶活性的影响

3 小结与讨论

作为神经递质多巴胺的羟基化衍生物，6-OHDA对很多物种都具有神经毒性。有研究发现，6-OHDA在体内外都显示出较强的氧化损伤能力，能够诱导细胞大量生成过氧化氢等物质，同时下调相关抗氧化酶活性，促使活性氧的大量快速聚集。当活性氧的产生超出神经元的清除能力时，细胞内的脂质膜结构将会受到攻击，从而导致神经毒性作用的产生[7]。试验用6-OHDA 成功构建了PC12 细胞损伤体外PD 模型，相较于空白对照组，加入6-OHDA 后，PC12 细胞活力显著降低，ROS 水平和MDA 含量显著升高，而相关抗氧化酶活性显著降低。

氧化损伤是PD 发生和发展的主要机制之一，氧化应激启动并加重PD 反应，其主要原因是ROS 的过度产生。作为一种强化学介质，ROS 能够作用于细胞膜受体激酶，对多种细胞信号转导途径进行调节，损伤细胞大分子结构，攻击细胞脂质膜结构，产生神经毒性，最终导致PD 的发生[8]。有研究表明，植物提取物能够抑制6-OHDA 诱导的细胞ROS 的过度释放，如红景天苷能够减少6-OHDA 诱导的SH-SY5Y 细胞中ROS 的过度产生而发挥其抗氧化作用[9]。该研究发现，6-OHDA 能够诱导PC12 细胞ROS 大量增加，使细胞活力下降，而添加不同浓度枳实黄酮提取物可以降低6-OHDA 诱导的PC12 细胞内ROS 水平。

ROS 的过度增加会加剧细胞氧化损伤程度，正常情况下抗氧化酶如SOD、CAT 和GSH-Px 可以调控自由基的水平，而细胞损伤程度也可以通过MDA 含量反应[10]。植物提取物可以通过提高这些抗氧化酶活性降低MDA 含量达到治疗PD 的效果。如璋芝多糖对帕金森小鼠显示出较好的治疗效果，其效果与调控抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 活性，降低MDA 含量相关[11]。研究发现，枳实黄酮提取物可以显著抑制6-OHDA 诱导的PC12 细胞MDA 含量的升高，同时通过相关检测也发现其可以显著提高GSH-Px、SOD和CAT 等抗氧化酶活性，且这些变化都呈剂量正相关。

综上所述，通过细胞生物学及分子生物学分析手段证实枳实黄酮提取物可以有效抑制6-OHDA 诱导的PC12 细胞的损伤，为枳实黄酮的应用提供了理论依据，其具体抗神经损伤机制还有待进一步研究。