传统虾酱中酵母菌分离鉴定及碳源利用特性

徐文欢，吴若菡，李采婵，吕 静，纪超凡，梁会朋，孙泽平，林心萍

（大连工业大学食品学院 国家海洋食品工程技术研究中心 辽宁大连116034）

“虾酱”是中国沿海地区及东南亚地区人们常用的调味料之一，是以毛虾等小型虾类经腌制、捣碎、发酵制成的糊状食品[1]，其滋味鲜美，回味无穷，具有独特的风味。我国的虾酱生产主要集中在沿海地区，如辽宁、山东、天津、江苏、广东、海南等[2]。

虾酱的发酵是一个较为复杂的化学变化过程，传统的虾酱生产通常采用自然发酵，且发酵过程受到季节、天气、温度等诸多不可控因素影响，使虾酱的生产周期长，品质不稳定，不利于大规模工业化生产。国内外专家、学者对不同地区的虾酱发酵工艺及品质进行研究。如：吴帅等[3]研究了低值虾酱发酵中的风味变化；苑宁等[4]阐述了虾酱生产过程中的品质变化，以及容易引起食品安全问题的不良因素。还有一部分学者对虾酱中的微生物进行分离，例如：石敏等[5]从侗族传统虾酱分离获得一些具有蛋白酶、脂肪酶以及其它酶类的活性乳酸菌；孙业盈等[6]从蜢子虾酱中分离鉴定出1株中度嗜盐菌MKY2；连鑫等[7-8]从李锦记公司提供的广东传统发酵虾酱中分离鉴定出产香酵母和产蛋白酶霉菌；吕欣然等[9]在锦州传统虾酱中分离出蛋白酶嗜盐菌。大连因处于黄、渤海交界海域这一独特的地理位置，故造就了大连传统虾酱与众不同的风味和口感，这与其自身特有微生物环境有着密切联系。过去对传统虾酱中酵母菌多样性及特性的研究甚少，也鲜有对酵母菌碳源同化利用特性的研究。

本研究通过对大连虾酱中酵母菌的分离纯化，采用26S rDNA 菌株进行种属鉴定，对所分离的酵母进行碳源同化特性研究，所得结果对虾酱发酵优良菌株的筛选以及工艺优化有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品虾酱，大连竹岛食品公司的生制虾头酱。

1.2 培养基与试剂

YEPD 培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母10 g/L，pH 6.0，121 ℃灭菌20 min。

碳源同化培养基：硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，琼脂粉15 g/L，碳源（葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、柠檬酸、壳聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖）20 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃灭菌20 min。

甘露醇（分析纯）、壳聚糖（分析纯）、甘油（分析纯），天津市光复精细化工研究所；N-乙酰-D-氨基葡萄糖，上海晨易生物科技有限公司；D-山梨糖醇，生工生物工程（上海）有限公司；柠檬酸，天津市石英钟厂霸州市化工分厂；蔗糖（分析纯）、乳糖（分析纯）、葡萄糖（分析纯），天津市福晨化学试剂厂。

1.3 仪器与设备

DRP-9162 电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；超净工作台，上海博迅实业有限公司；PCR 仪，美国伯乐公司；高压蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；凝胶成像系统，以色列DNR 公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分离纯化 在无菌条件下，取5 g虾酱于45 mL 无菌水中摇匀，过滤。取合适的梯度进行稀释，稀释后溶液取0.2 mL，均匀涂布于PDA培养基平板上，封口后置于30 ℃培养48 h。选取菌落数为30～300 的平板，挑取清晰单菌落或不聚成堆菌落重新平板划线分离，培养一定时间后，挑取单菌落，在PDA 平板上划线纯化，直至得到纯种单菌落，观察并记录菌落形态，置于4 ℃保存备用。

1.4.2 菌株的形态学鉴定 观察分离纯化后酵母菌的菌落形态特征，从颜色、光滑度、致密性等方面观察并记录。取典型菌落进行镜检，于40 倍物镜下观察菌体形态并采集图像。

1.4.3 酵母菌的碳源同化 共配制9 种碳源同化培养基，9 种碳源包括葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、柠檬酸、壳聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

将分离纯化后的酵母菌分别接种于9 种培养基平板上，30 ℃培养相同时间，取出后观察各培养基上每种酵母菌的生长状况，进行对比，总结每种酵母菌适宜的碳源生长条件，并采集图像。

1.4.4 菌株基因组的提取 取保藏在-20 ℃的菌株，加入1 mL 纯净水悬浮，13 000 r/min 离心30 s。再加入400 μL TES 和0.3 g 左右的玻璃珠，室温放置5 min。冰浴1 min，用涡旋振荡仪（最大功率）振荡1 min，反复5 次。再加入200 μL 饱和酚溶液，200 μL 氯仿异戊醇，室温作用5 min。冰浴1 min，振荡1 min，反复5 次。13 000 r/min 4 ℃离心10 min。取上清，加入1/10 体积的3 mol/L 醋酸钠，2 倍体积冰冷无水乙醇，-20 ℃沉淀20～60 min。13 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇，颠倒反复洗涤沉淀，13 000 r/min离心2 min，弃上清，晾干。加入适量的TER（1 mL的TE 缓冲液中加入1 μL 10 μg/μL 的RNA 酶），37 ℃温 育20 min。取1 μL 进行电泳，与λ HindIII marker 电泳条带进行比较，采用凝胶成像仪观察并采集图像。

1.4.5 菌株26S rDNA PCR 扩增 PCR 采用通用引物26S1：5 ’-GCATATCAATAAGCGGAG GAAAAG-3’，26S2：5’-GGTCCGTGTTTCAAGA CGG-3’进行扩增。

PCR 反应体系 （50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq 酶0.5 μL，模板2 μL，超纯水36.5 μL。PCR 反应条件：94 ℃5 min；94 ℃20 s，50℃30 s，72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃10 min；4℃∞。取PCR 产物5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.6 DNA 测序及系统发育树建立 PCR 产物的测序工作由生工生物工程（上海） 有限公司完成。将所得序列在NCBI 数据库中进行BLAST 同源性比对分析，得到序列后用软件MEGA5.2 进行分析，制作成系统发育树。

2 结果与分析

2.1 虾酱中酵母菌的分离与鉴定

2.1.1 菌落的形态学观察结果 以大连传统虾酱为原材料，以PDA 为培养基，共分离纯化出8 株酵母菌。该8 株酵母经过多次平板划线分离纯化，确定为纯菌落，分别编号为Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8。对以上8 株酵母菌进行形态学观察和显微镜检测，菌落形态及镜检结果如图1所示，各自具体菌落形态学描述见表1。由图1可见，这8株菌株中有2 株菌为红色，从菌落形态上看，表面光滑，不透明，产生红色色素。其余均为白色，表面光滑湿润，不透明，多呈白色，菌落的透明度、颜色都有所差异，其中，有2 株白色菌株的菌落边缘呈模糊状态。通过镜检可知，所分离的菌株大小符合酵母菌的大小，可进一步采用分子生物学的方法对其进行鉴定。

2.1.2 酵母菌的碳源同化试验结果 不同碳源对酵母菌的生长状况有不同影响，本试验采用葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、柠檬酸、壳聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖9 种常用微生物培养基碳源试材，对大连传统虾酱中分离纯化出的8 株酵母菌进行碳源同化试验，总结最适生长碳源，以及不同碳源对不同酵母菌的影响。

图1 虾酱中酵母菌Y1～Y8 号镜检（40×）及菌落形态学观察结果Fig.1 Microscopy（40×） and colony morphology of yeasts Y1-Y8 in shrimp paste

表1 酵母菌Y1～Y8 号的形态学特征Table 1 Morphological characteristics of yeasts Y1-Y8

将8 株酵母菌分别接种于9 种碳源培养基中，在培养时间相同的条件下，对不同培养基上的不同菌株进行形态学分析。根据形态学结果可以看出，从碳源角度来看，葡萄糖和蔗糖几乎适应所有酵母菌的生长，并且菌落生长很快，菌落旺盛；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油作为碳源也可以使每种酵母菌生长，然而对不同种类的酵母菌的生长促进情况不同，部分酵母菌生长速度较快且旺盛，部分酵母菌生长缓慢；壳聚糖培养基上没有任何酵母菌的生长迹象。葡萄糖、蔗糖等[10]是最常用的碳源，然而其来源通常采用淀粉水解等方式获得。开发新的可利用碳源，如氨基葡萄糖[11]可来源于甲壳素水解产物，甘油[12-13]可来源于生物柴油加工废弃物等，有助于拓宽微生物的碳源谱，以降低原料成本。

根据表2可以得出结论，对于这8 株酵母，经鉴定为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的菌株Y1、Y6，在以葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇和氨基葡萄糖为碳源的培养基中均可正常生长，其中在葡萄糖和蔗糖培养基中生长情况最为良好，而在乳糖、壳聚糖和柠檬酸培养基中不能生长；Y2 酵母菌株近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）在除乳糖和壳聚糖以外的其它碳源培养基中均能正常生长，且在葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖培养基中生长情况最好；Y3 和Y4 已鉴定为同种酵母菌株龙贡毛孢子菌（Trichosporon domesticum），在除柠檬酸和壳聚糖以外的其它碳源下均能正常生长，其中在以葡萄糖、乳糖、蔗糖和氨基葡萄糖为碳源的培养基中生长情况最好；Y5、Y7 和Y8 已鉴定为同种酵母菌株汉斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii），在除乳糖和壳聚糖以外的其它碳源下均能正常生长，在以葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和氨基葡萄糖为碳源的培养基中生长情况最好。由表2可见，从传统虾酱中分离出的菌株，普遍具有能够利用氨基葡萄糖的特性，这预示着这些菌株具有利用氨基葡萄糖作为碳源的潜质[11]。从这8 种菌株碳源利用的分析可见，葡萄糖和蔗糖的碳源利用谱最广，壳聚糖的碳源利用谱最窄[14]。这些微生物的挖掘，可为之后开发虾酱发酵剂奠定菌株基础。

表2 8 株酵母菌碳源同化试验结果分析Table 2 Analysis of 8 yeast carbon source assimilation

2.2 酵母菌DNA 提取及26S rDNA PCR 扩增结果

以提取的8 株酵母菌基因组为模板，采用通用引物26S1 和26S2 扩增结果，经琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶成像系统检测结果如图2所示，可以观察到所有泳道的600 bp 左右位置均出现了一条清晰条带且特异性强。将样品中的PCR 片段进行回收纯化后，送测序公司进行测序。

图2 8 株酵母菌26S rDNA PCR 产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of 26S rDNA PCR amplification result from eight isolated yeasts

2.2.1 虾酱中26S rDNA 序列同源性分析及系统发育树的建立 测序结果利用BLAST 工具，与NCBI 数据库进行同源性对比，比对结果如表3所示。由表3结果可知，菌株Y1 与胶红酵母FJ009291.1 同源性达到100%，菌株Y6 与胶红酵母FJ515247.1 同源性达到99%，可鉴定Y1、Y6 为胶红酵母；菌株Y2 与近平滑假丝酵母EU605809.1 同源性达到100%，可鉴定其为近平滑假丝酵母；菌株Y3、Y4 与龙贡毛孢子菌JN939470.1 同源性达到99%，可鉴定其为丝孢酵母（Trichosporon domesticum）；菌株Y5 与汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）JX649975.1 同源性达到100%，菌株Y7、Y8 与汉逊德巴利酵母LC219505.1 同源性达到100%，可鉴定菌株Y5、Y7、Y8 为汉逊德巴利酵母。

表3 酵母菌26S rDNA 序列分析结果Table 3 Results of 26S rDNA sequence analysis for 8 yeasts strains

根据同源性分析结果，选择同源性较高的不同参考菌株的序列，使用本地软件Mega7.0，运用Neighbor-Joining 法构建系统发育树，结果如图3所示。由图3可以看出，菌株胶红酵母FJ009291.1与胶红酵母FJ515247.1 在同一分支上，亲缘关系最近，形成第1 类群；菌株丝孢酵母JN939470.1形成第2 类群；菌株近平滑假丝酵母EU605809.1形成第3 类群；菌株汉逊德巴利酵母JX649975.1与汉逊德巴利酵母LC219505.1 在同一分支上，亲缘关系最近形成第4 类群。所有分离株与相对应的参考菌株同源性都在99%和100%，证明酵母菌26S rDNA 序列分析结果准确，置信度高。

3 结论

图3 大连虾酱酵母分离株26S rDNA 序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of yeast from Dalian shrimp paste based on 26S rDNA sequence

本试验中分离并鉴定的酵母菌均被报道在发酵食品中与食物的蛋白质、脂肪、碳水化合物产生互相作用，对发酵食品的风味、口感、安全和营养方面等产生了有益作用。例如，Salgado 等[15]对葡萄酒中汉逊德巴利酵母产生挥发性化合物的研究表明，该酵母可产生对应10 类的挥发性化合物：萜烯、高级醇、C6 醇、醛类、挥发性物酸、乙酸酯、乙酯、挥发性酚、硫化合物和烃等，这些化合物可使葡萄酒的香气更加浓醇，对改善口感起到了作用。李亚莉等[16]采用近平滑假丝酵母接菌普洱茶，结果表明，接菌的发酵茶样中主要功能成分含量均较自然发酵茶叶中的含量高，具有传统普洱茶的品质风味，且在香气和滋味方面有自身的特点，滋味醇和、厚滑，香气纯正略带乳香，说明近平滑假丝酵母对发酵普洱茶的风味、口感等起到一定的改善作用。此外，还有研究表明，海洋胶红酵母[17]具有抗菌、抑霉等特点，可提高发酵食品的品质，延长其食品保质期。毛俊霞[18]研究发现，胶红酵母中富含多种氨基酸，而且天冬氨酸、谷氨酸、丙氨基酸的含量较高，粗蛋白的含量为37.8%±0.52%，且由于其自身产类胡萝卜素等特点，赋予了食品抗氧化性及新的营养特性，具有提升营养价值的作用。本研究中发现的这些酵母，推测可能在虾酱特殊气味、营养等的形成方面具有重要作用，可促进虾酱中的蛋白质分解形成氨基酸，增加其独特鲜味，赋予虾酱浓郁的口感；此外，还具有提高其营养价值的作用，可能对发酵食品保质期的延长起到促进作用。

碳源同化能力[19]是判断微生物利用不同碳源能力的指标，是微生物进行鉴定的生理生化指标，将为鉴定微生物的辅助特征提供有益补充。本文研究发现，胶红酵母对葡萄糖和蔗糖的利用能力较好，对甘油的利用率次之，不能利用乳糖和壳聚糖。毛俊霞[18]的研究表明，发现在重庆不同果园土壤中分离的胶红酵母对蔗糖、甘露醇和甘油的利用率比较高；李新玲等[20]在自制酸驼乳中发现了1株胶红酵母，其碳源同化试验也表明，胶红酵母对蔗糖的利用程度较高。在虾酱中发现的胶红酵母的碳源同化能力与其他研究人员的结果类似。Rivas 等[21]在玉米芯中提取的汉逊德巴利酵母优先利用葡萄糖，其次是木糖以及阿拉伯糖等；Koganti 等[22]发现，汉逊德巴利酵母可高效利用甘油，高选择性地生产阿拉伯糖醇，产量达55%，说明甘油为汉逊德巴利酵母的优良碳源，可能还对于代谢产物的生产具有一定的选择性。本研究也发现，汉逊德巴利酵母优选葡萄糖、蔗糖及山梨糖醇，此外，该酵母对甘油的利用比较显著。丝孢酵母和近平滑假丝酵母对碳源的选择性也与文献报道一致，张玉瑧等[23]分离获得的1 株丝孢酵母对葡萄糖和蔗糖利用效果最好；Preziosi-Belloy 等[24]用近平滑假丝酵母菌发酵半纤维素糖，在葡萄糖质量浓度和甘露糖质量浓度分别为27 g/L 和6 g/L 时，可正常生长，当高于此浓度时，受到抑制，因此可以看出，葡萄糖和甘露糖为近平滑假丝酵母的碳源。碳源利用程度[25]是评价微生物特性的指标，本试验结果将为今后筛选优良的发酵菌株及发酵生产菌株碳源的选择提供一定参考。

从传统虾酱中共分离出8 株酵母菌，通过对该8 株酵母菌的形态学和分子生物学鉴定，鉴定结果为2 株胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa），1 株近平滑假丝酵母 （Candida parapsilosis），3 株汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），2 株丝孢酵母（Trichosporon domesticum）。对8 株酵母菌的碳源同化试验结果表明，葡萄糖和蔗糖为酵母菌生长的最优碳源；氨基葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油虽然可以使每种酵母菌生长，但利用程度不同；乳糖和柠檬酸只能促进部分种类酵母菌生长；而壳聚糖不宜用作酵母菌生长的碳源。这些微生物的挖掘，可为今后开发虾酱发酵剂奠定菌株基础，同时，也对促进虾酱中微生物资源利用，筛选合适发酵剂，推动大连传统虾酱产业发展起到积极作用。