第二信使分子调控细菌胞外多糖生物合成研究进展

艾连中，范艺周，熊智强

（上海理工大学医疗器械与食品学院 上海食品微生物工程技术研究中心 上海200093）

为适应复杂的外界环境，感知细胞外信号并将其传递，对细菌生存尤为重要。信使分子环二鸟苷酸 【Bis-（3'-5'） cyclic di-guanylate acid，cdi-GMP】和环二腺苷酸（Cyclic dimeric adenosine 3'-5'-monophosphote，c-di-AMP）在信号传递中发挥着重要作用（图1）。c-di-GMP 广泛介导细菌运动性、细胞毒性、细胞周期进程和胞外多糖合成等多种生理功能的信号转导[1-2]。c-di-GMP 代谢过程涉及2 种关键酶——二鸟苷酸环化酶（Diguanosine cyclase，DGC） 和磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE），2 分子GTP 在DGC 催化下合成1分子c-di-GMP，而c-di-GMP 能被PDE 水解为5'-pGpG【5'-phosphoadenylyl-（3'-5'）-guanosine】或GMP[3]。

c-di-AMP 是继c-di-GMP 之后发现的新型第二信使分子，在细菌和古生菌中广泛存在，尤其在厚壁菌门中。c-di-AMP 首次在海栖热袍菌DisA 蛋白 （DNA integrity scanning protein A）晶体结构中发现[4]。二腺苷酸环化酶（Diadenylate cyclase，DAC） 能够以2 分子ATP 或ADP 为底物合成1 分子c-di-AMP，而c-di-AMP 在磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）催化下水解为5'-pApA【5'-phosphoadenylyl-（3'-5'）-adenosine】，少数情况下水解为AMP。随着c-di-AMP 受体蛋白及保守结构域被鉴定，使c-di-AMP 介导细菌生理功能的分子机制逐渐清晰，c-di-AMP 可调控脂肪酸代谢、钾离子稳态、渗透压调节、细胞毒力和生物膜形成等生理功能[5-7]。

图1 c-di-GMP 和c-di-AMP 的分子式Fig.1 The molecule formulas of c-di-GMP and c-di-AMP

1 第二信使分子代谢

1.1 c-di-GMP 代谢

细菌中第二信使分子介导的信号通路主要包括3 个环节：1）合成酶和分解酶；2）受体靶标；3）受体靶标调控的下游基因（表1）。在DGC 和PDE共同作用下细胞内的c-di-GMP 严格控制在稳定水平。在DGC 催化合成过程中，不仅能够保证细胞内c-di-GMP 的浓度，还能避免过度消耗GTP。DGCs 通常含有2 个c-di-GMP 结合位点：A 位点和I 位点，A 位点即GGDEF 结构域的GGDEF 基序，是催化合成的活性位点，而I 位点即RXXD 基序，与c-di-GMP 结合使两位点产生竞争并抑制c-di-GMP 合成，这种反馈调节保证细胞内c-di-GMP 的代谢处于动态平衡。对于不具备I 位点的DGCs，只能在DGCs 与PDEs 的共同作用下才能维持代谢平衡。PDEs 含有EAL 结构域或HDGYP 结构域。EAL 结构域被二价金属离子Mg2+或Mn2+激活后可以水解c-di-GMP 为GMP，而Zn2+和Ca2+则抑制其水解活性。HD-GYP 结构域的水解产物为5'-pGpG。DGC 和PDE 能够通过特定结构域感知抗生素、磷酸化反应、金属离子、光和小分子等外界刺激，触发c-di-GMP 介导的信号通路，如PAS 结构域能够感知金属离子变化，REC 结构域感知磷酸化反应和GAF 结构域感知光信号。

表1 c-di-GMP 和c-di-AMP 介导的信号通路Table 1 c-di-GMP and c-di-AMP mediated signaling pathways

1.2 c-di-AMP 代谢

在细菌中c-di-AMP 以级联方式进行信号传导，目前具有DAC 活性的蛋白主要有DisA、CdaA（也称DacA 或YbbP）、CdaS （也称YojJ） 和CdaM[14，21]，其催化活性在保守DAC 或DisA_N 结构域。DisA 以八聚体形式存在，其C 端DNA 结合基序HhH 有助于四聚化，而N 端DAC 结构域有助于二聚化[5，18，22]。CdaA 除保守DGA 和RHR 基序，还含有3 个跨膜结构和2 个卷曲螺旋结构。单增李斯特菌中截短的CdaA （不含跨膜结构域）以二聚体形式存在，其活性受调控蛋白CdaR 影响。CdaS 与CdaA 氨基酸序列同源性约40%，CdaS 以六聚体形式存在于芽孢杆菌属和梭菌属[23]。DisA、CdaA 和CdaS 均为严格的二价金属离子依赖型催化酶，在碱性条件下酶活最高。

已报道的PDE 蛋白主要有GdpP（GGDEF domain protein-containing phosphodiesterase）、PgpH 和Pde2，其催化活性在保守的DHH/DHHA1或HD 结构域[24]。最先发现的PDE 蛋白是GdpP，该蛋白包含1 个退化的GGDEF 结构域，1 个PAS感觉结构域，1 个DHH/DHHA1 结构域和2 个跨膜结构。Cho 等[25]发现化脓链球菌GdpP 跨膜区的空间结构对其催化活性至关重要[26]。Pde2 是仅含有DHH/DHHA1 结构域的PDE，与GdpP 不同的是，Pde2 不仅水解c-di-AMP 为5'-pApA，而且能进一步水解5'-pApA 为AMP[27-28]。含HD 结构域的PgpH 也具有PDE 活性，可水解c-di-AMP 为5'-pApA，其催化活性受另一种核苷酸信号分子ppGpp 的抑制。PDE 水解活性也需要二价金属离子才能在碱性条件下表现出较强的酶活性[29]。目前c-di-AMP 代谢蛋白中仅报道GdpP 含PAS 感知结构域，而嗜热链球菌S-3 的GdpP 蛋白不含PAS 结构域[30]。Zeden 等[31]研究表明谷氨酰胺和铵盐可调节金黄色葡萄球菌c-di-AMP 代谢蛋白活性，影响胞内c-di-AMP 水平。进一步分析gdpP和ybbR 突变体中谷氨酰胺和铵盐浓度改变对cdi-AMP 水平的影响，发现谷氨酰胺和铵盐并非通过PDE 和DAC 调节YbbR 蛋白而影响c-di-AMP浓度。虽然作者未确定谷氨酰胺和铵盐作用的具体靶标，但是这仍表明细菌内氨基酸或小分子会影响胞内c-di-AMP 浓度。鉴于此，对不含感知结构域的c-di-AMP 代谢蛋白，其信号感知是一个重要的研究方向。

2 第二信使分子受体靶标

精确控制细菌具体生理过程需深入研究信使分子与受体靶标的相互作用。目前第二信使分子的受体靶标主要有：1） 含有特定结构域或位点的蛋白；2）转录调节因子；3）核糖开关（图2）。c-di-GMP 受体靶标较为透彻，退化的GGDEF 结构域和EAL 结构域虽丧失催化活性，但能结合c-di-GMP 介导细胞膜形成和细菌毒力等生理过程[8]。c-di-GMP 特异性结合PilZ 结构域，使该结构域构象发生改变，这是一种相对简单且广泛存在的调节方式[32-33]。c-di-GMP 还可通过受体蛋白及其相邻蛋白结构或活性的变化调节细胞功能。铜绿假单胞菌中相邻蛋白Alg8 和Alg44 催化海藻酸钠聚合，当胞内c-di-GMP 处于较低水平时，Alg44抑制Alg8 活性，而胞内c-di-GMP 浓度升高，cdi-GMP 与Alg44 的PilZ 结构域结合，可解除抑制并调节下游分子。鲍曼不动杆菌中，c-di-GMP 结合位点为PgaC 和PgaD 蛋白的界面口袋。在不存在c-di-GMP 的情况下，PgaD 会迅速降解并关闭胞外多糖的合成。c-di-GMP 不仅能特异性结合相应的受体蛋白，改变酶活性或酶结构介导多种信号通路，还能通过结合转录调节因子引起下游基因表达改变。大肠杆菌1094 转录调节因子CsgD和铜绿假单胞菌FleQ 与c-di-GMP 结合分别促进和抑制相关基因的表达[1，3]。c-di-GMP 受体靶标其保守的结构域或结合位点相对单一，目前仅有PilZ 结构域和I 位点等少数结构域可特异性结合c-di-GMP，而特异性结合c-di-AMP 结构域包括USP[9]、DUF970[10]、CBS[34]、TrkA_N 和TrkA_C[6]及RCK_N 和RCK_C 等[11，35]（表1）。尽管c-di-AMP受体蛋白保守结构域具有多样性，其响应方式还相对单一且不同于c-di-GMP。

3 第二信使分子调控细菌胞外多糖生物合成

细菌胞外多糖是代谢过程中分泌到胞外的一类高分子聚合物，因其独特的流变学特性、物理学特性、良好生物相容性而在食品和医药等领域发挥着重要作用[36]。细菌胞外多糖生物合成受eps 基因簇控制，通常包含调控基因、链长决定基因、重复单元合成基因及多糖聚合和输出基因[37]。

3.1 c-di-GMP 调控细菌胞外多糖生物合成

c-di-GMP 介导纤维素、Pel 多糖、Psl 多糖、海藻酸钠、聚乙酰葡萄糖胺和凝胶多糖等细菌胞外多糖生物合成。例如，铜绿假单胞菌中c-di-GMP通过含PilZ 结构域的Alg44 蛋白及其相邻蛋白Alg8 的相互作用来调节海藻酸钠生物合成，通过转录调控因子FleQ 与pel 操纵子和psl 操纵子的启动子区域结合转录调控Pel 多糖和Psl 多糖的生物合成[1，3]。铜绿假单胞菌基因组中编码膜蛋白MucR、RoeA、SadC、BifA 和SiaD 及非膜蛋白WspR和DgcP 等多种c-di-GMP 代谢蛋白，这些c-di-GMP 合成酶和分解酶部分用于调节胞内c-di-GMP 整体水平，部分仅改变c-di-GMP 局部浓度并通过周围分子影响细胞代谢或其它生理生化过程。Nicastro 等[38]研究表明在fimV（编码T4 型菌毛组装蛋白）突变体中过表达dgcP（编码c-di-GMP合成酶）导致生物膜形成严重受损。过表达wspR（编码另一种c-di-GMP 合成酶） 能够弥补dgcP突变造成的c-di-GMP 水平降低，且在dgcP 与fimV 突变体中过表达wspR，使胞外多糖合成与生物膜形成与野生型相比没有显著差异，表明DgcP是c-di-GMP 水平的局部调节剂。鉴于c-di-GMP在铜绿假单胞菌胞外多糖生物合成中的重要作用，可通过操纵胞内c-di-GMP 水平或改造受体蛋白同源物来提高胞外多糖合成。此外，Nicastro等[38]还发现LB 培养基和TSB 培养基中dgcP 突变体生物膜形成受损，而在M63 与M8 培养基中dgcP 突变对生物膜形成无显著影响。由于胞外多糖作为生物膜基质的主要组成部分，作者推测cdi-GMP 对胞外多糖调节与培养基存在关联，因此，同时控制胞内c-di-GMP 水平和培养基有望实现细菌胞外多糖的高效合成[39]。

图2 c-di-GMP 和c-di-AMP 介导的细菌信号通路Fig.2 The bacterial signaling pathway mediated by c-di-GMP and c-di-AMP

分析c-di-GMP 受体蛋白结构发现，c-di-GMP 调控细菌胞外多糖的信号通路还涉及相应的糖基转移酶。木醋杆菌中AscA 蛋白含有PilZ和糖基转移酶结构域，c-di-GMP 与AscA 结合控制纤维素生物合成。铜绿假单胞菌中c-di-GMP通过受体蛋白Alg44 及其相邻蛋白Alg8 共同发挥调控海藻酸钠生物合成，而Alg8 含糖基转移酶结构域。根癌农杆菌胞内c-di-GMP 浓度提高刺激含PilZ 结构域的CelA 糖基转移酶亚基活性，进而提高纤维素的合成与分泌。此外，鲍曼不动杆菌PgaC 和鼠疫耶尔森氏菌HmsR 两种c-di-GMP 受体蛋白也含有糖基转移酶结构域[3]。虽然不是所有细菌都通过c-di-GMP 与糖基转移酶相互作用来调控胞外多糖的合成与分泌，但是上述这些研究为寻找调控胞外多糖的受体蛋白及其保守结构域或基序提供指导。

3.2 c-di-AMP 调控细菌胞外多糖生物合成

c-di-AMP 调控细菌胞外多糖的研究起步较晚，目前仅在变形链球菌和枯草芽孢杆菌生物膜研究中发现c-di-AMP 参与胞外多糖的合成与分泌[6，39]。在枯草芽孢杆菌中c-di-AMP 通过负转录调节因子SinR 及其运动蛋白SlrR 相互作用来控制聚-N-乙酰氨基葡萄糖 （PNAG） 的生物合成。PNAG 合成主要由epsA-O 基因簇控制，负转录调节因子SinR 可与epsA-O 操纵子启动子区域结合抑制基因表达，而c-di-AMP 与SinR 结合可以解除这种抑制，促进PNAG 的合成；SinR 的DNA结合活性受SlrR 影响，SlrR 与SinR 的结合也可缓解这种抑制。由于SlrR 限制运动性和自溶素基因的表达，当枯草芽孢杆菌中c-di-AMP 浓度升高或降低时，SinR 与epsA-O 操纵子或SlrR 的相互作用，使得细胞可以在浮游状态和生物粘附状态之间自由切换[36-37]。c-di-AMP 与转录调节因子SinR 相互作用研究丰富了c-di-AMP 介导的信号网络，在分子水平调节细胞内PNAG 合成。

变形链球菌能通过GtfB，GtfC 和GtfD 3 种葡糖基转移酶将蔗糖转化为水溶性或水不溶性葡聚糖，该过程受c-di-AMP 控制[40]。变形链球菌中cdi-AMP 的代谢相对简单，只含1 种DAC 蛋白CdaA 和1 种PDE 蛋白PdeA。Cheng 等[41]发现在cdaA 突变体中200 个基因的表达量发生显著变化，且大多数基因与细菌胞外多糖合成和氧化还原相关，推测c-di-AMP 浓度降低导致胞外多糖产量升高，是为了避免氧化应激损伤。然而，Peng等[6]获得了完全不同的试验结果，他们发现细胞内c-di-AMP 水平下降抑制胞外多糖合成，而不是促进胞外多糖合成[42]。受体蛋白CabpA 通过保守结构域TrkA_C 与c-di-AMP 和蛋白VicR 相互作用调控葡聚糖合成。目前CabpA 和VicR 互作机制尚未明晰，其调节机制可能是c-di-AMP 与CabpA 结合，导致VicR 无法与CabpA 相互作用，使游离的VicR 与gtfB-D 操纵子结合并促进gtfB 表达，造成葡聚糖合成显著增加[43]。Cheng 等[41]的研究局限于基因突变或过表达引起的表型变化，而Peng 等[7]鉴定了c-di-AMP 受体蛋白，完善了cdi-AMP 介导的变形链球菌葡聚糖生物合成信号网络，未解析c-di-AMP 介导的胞外多糖信号网络的分子机制。虽然c-di-AMP 在变形链球菌葡聚糖合成中的作用尚不明确，但可以确定c-di-AMP 参与胞外多糖合成的信号转导。

4 结论

c-di-GMP 和c-di-AMP 是细菌中广泛存在的第二信使分子，在细胞代谢和生物学进程的调控中发挥着重要作用。近年来c-di-GMP 和c-di-AMP 介导细菌胞外多糖生物合成的信号机制逐渐清晰，尤其是c-di-GMP 调控。目前c-di-GMP代谢蛋白及受体靶标的研究较为成熟，而c-di-GMP 新受体靶标鉴定、c-di-GMP 多种代谢蛋白的不同调节模式及c-di-GMP 与其它信号系统的互作都是未来的研究热点。有关c-di-AMP 对细菌胞外多糖合成调控的研究起步较晚，其信号机制还有待完善，目前仅在枯草芽孢杆菌与变形链球菌中有初步研究。对于高产胞外多糖而不编码合成c-di-GMP 的优良菌株，c-di-AMP 对其胞外多糖的合成调控仍是未来的研究重点。对c-di-GMP 和c-di-AMP 调控的细菌信号机制的分析表明，c-di-GMP 受体靶标的结合位点虽具有保守性，但响应方式多样，而c-di-AMP 与受体靶标的结合位点虽多样，但结合方式保守，因此鉴定新的c-di-GMP/c-di-AMP 受体蛋白对于全面揭示第二信使分子的信号调节网络至关重要。第二信使分子可在转录、转录后及翻译后水平对细菌多种代谢过程进行调控，已成为一类高度保守的分子控制机制，这也为全面揭示c-di-GMP 和c-di-AMP对细菌胞外多糖的合成调控奠定基础。