高效原油污染降解菌的筛选、鉴定及菌群的构建

朱淑芳 EHENEDEN Iyobosa 宁海军 尚洁昊 李武阳 孟宪刚

（兰州交通大学化学与生物工程学院，兰州 730070）

石油是地下岩石中生成的、液态的、以碳氢化合物为主要成分的可燃性矿产，且直接从油井中开采出来未加工的石油称为原油［1］。原油按组成分类分为蜡基原油、环烷基原油和中间基原油3类。石蜡基原油中烷烃较多；环烷基原油含环烷烃、芳香烃较多；中间基原油介于二者之间［2］；根据相对密度分为重质原油（d420，0.9-1.0）和低质原油（d420，0.77-0.85），重质原油也称为稠油，稠油与普通原油相比，胶质和沥青质的含量较高［3］。由于原油中含有烷烃、环烷烃、芳香烃、含硫化合物等，其芳香烃中一些苯系物（甲苯、乙苯和二甲苯）挥发性大，在原油的加工、运输、储存过程中容易释放到环境中，会对人体的血液、神经系统具有较强危害［4］。硫化物是形成酸雨的主要原因，SO2有刺激性气味，人吸入后会导致肺水肿甚至死亡［5］。

石油在开采、加工、运输过程中难免会产生石油污染物，石油污染已经成为我国突出的环境问题之一［6-7］。目前，工业上大多数都是用物理化学法处理原油污染物，而物理化学法处理成本高，存在二次污染。所以，以原油为唯一碳源，利用微生物降解原油污染物成了研究的热点。据研究报道，降解石油烃的微生物有200多种，其中，细菌对原油的降解能力优于真菌和放线菌［8］。常见原油降解菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、棒杆菌属（Corynebacterium）、微球菌属（Micrococcus）、产碱杆菌属等（Alcaligenes）［9-10］。但这些菌株大都针对部分石油烃成分或者是轻质原油，对于高黏度、高密度稠油的降解效果不是很显著。例如，宋永亭等［11］从油田采出水筛选得到一株枯草芽孢杆菌属（Bacillus subtilis sp.）S，在37℃、120 r/min对稠油处理14 d后，该菌株对沥青质降解率达34.87%。贾群超等［12］从石化厂周围的油泥中分离到两株不动杆菌属（Acinetobacter sp.）GS02和 GS07，将 1 g/L的稠油处理5 d后，降解率分别为45.3%和46.1%。任妍君等［13］用从稠油污染土壤中分离得到一株弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）DL1-G对稠油处理9 d后，该菌株对稠油的降解率39.89%。因此，筛选得到潜在的高效原油菌株对原油污染物的处理是至关重要的。本实验以山东原油污染污泥为研究对象，从实验室自有菌株及从污染源中分离出原油降解菌株，通过原油降解试验检测菌株对原油的降解能力，旨在筛选出原油高效降解菌株，并通过正交实验得到原油降解高效菌群，旨为石油污染物的生物法治理提供优秀的的烃降解菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 山东某油田的含油污泥、实验室自有菌种、山东某油田污染土壤。

1.1.2 试剂 牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）；蛋白胨（上海中秦化学试剂有限公司）；氯化钠（广东光华科技股份有限公司）；七水合硫酸镁（广东光华科技股份有限公司）；七水合硫酸亚铁（天津市苏庄化学试剂厂）；磷酸二氢钾（天津市大茂化学试剂厂）；硝酸铵（莱阳化工试验厂）；三氯化铁（烟台市双双化工有限公司）；硫酸铵（天津市北辰方正试剂厂）；硝酸钠（天津市百世化工有限公司）；一水合磷酸二氢钠（天津市北辰方正试剂厂）；硫酸铜（天津市化工三厂有限公司）；氯化钙（天津市大茂化学试剂厂）。

1.1.3 仪器 SW-CJ-2G型双人净化工作台（苏州净化设备有限公司）；SPX型智能生化培养箱（宁波东南仪器有限公司）；TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；电热恒温培养箱（DHP-9012）（上海一恒科学仪器有限公司）；电子天平（FA2004N）（上海精密科学仪器有限公司）；双功能水浴恒温振荡器（常州天瑞仪器有限公司）。

1.1.4 培养基 NA液体培养基［14］：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8-7.2，121℃灭菌20 min。NA固体培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8-7.2，121℃灭菌 20 min。SY 培养基［15］：初 筛 KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31 g，CaCl20.02 g，FeCl3痕量，原油2 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20 min。GJ培养基［15］：用于石油降解（NH4）2SO40.5g，NaNO30.5 g，KH2PO41 g，NaH2PO4·H2O 1 g，微量元素液 2 mL，pH 7.0，原油2 g，121℃高压蒸汽灭菌20 min。微量元素液：ZnSO40.1%，CaCl20.1%，CuSO40.15%，MgSO4·7H2O 0.4%，FeSO4·7H2O 0.15%。

1.2 方法

1.2.1 菌源的制备及富集培养 参考文献［15］中的方法，取10 g油泥溶于90 mL的无菌水中，在恒温振荡培养箱摇4 h后，静置沉淀2 h，以上清液作为菌源，取2 mL上清液加入富集培养基中，以转速150 r/min，30℃恒温培养136 h，再吸取5 mL浑浊培养液加入到新鲜的SY培养基中，按上述条件连续培养3-4次，实现降解石油烃菌的富集。

1.2.2 高效菌株的分离纯化 将上述1.2.1中制得的菌悬液取5 mL接种于GJ培养基中，在30℃，150 r/min的培养条件下，用恒温振荡培养箱培养至GJ培养基浑浊，吸取1 mL做梯度稀释涂布接种于石油平板上，30℃恒温培养5-7 d，在NA培养基中反复划线纯化后得到单一菌落。

1.2.3 高效菌株的定性筛选 用2，6-二氯酚靛酚（2，6-dichlorophenol indophenol，DCPIP）方法［16-17］筛选石油降解菌株，纯化后的菌株用初始发酵培养基（150 r/min、30℃）发酵培养48 h，10 000 r/min离心15 min，然后用0.85% NaCl 溶液洗涤两次，调整其OD600为1。取一离心管并在其中加入200 μL GJ培养基（未添加石油）、30 μL 石油、20 mg/L DCPIP 作为氧化还原指示剂，加30 μL 经上述处理的菌液后，在30℃下培养72 h，通过DCPIP颜色的变化作为衡量菌株降解石油的能力标准。每株菌株做3组平行样。

1.2.4 高效菌株的16S rRNA基因序列的扩增及测定 将分离筛选的菌株分别接种于NA液体培养基中，30℃、150 r/min 振荡培养至对数期后期或稳定期，菌液浑浊。每个菌株分别取2 mL 菌液于离心管中，12 000 r/min 离心2 min，弃上清液留菌体，向离心管中加入500 μL无菌双蒸水，涡旋30 s，置95℃水浴 5 min，12 000 r/min离心2 min。以上清液作为模板［18］。

采用细菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R ：5′-TACGACTTAACCCCAATCGC -3′对分离得到的菌株进行PCR扩增。反应体系（25 μL）：PCR MIX 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板 1 μL，扩增程序为 ：95℃预变性5 min，进入PCR循环，94℃变性45 s，54℃退火 1.5 min，72℃延伸 10 min［19］。

1.2.5 高效菌株的定量筛选 将从1.2.4中筛选得到的菌株在NA培养基中进行活化，使菌液的OD600值为1，吸取8 mL菌液接种到含油量为0.25%的GJ培养基中，150 r/min、30℃下培养7 d后用重量法检测石油的降解率，每组试验3个平行，取平均值。

1.2.6 重量法检测原油的降解率 参照 Gao等［20］的方法用重量法测定菌株对石油的降解率，用三氯甲烷萃取1.2.5中培养7 d后的处理液，在每个处理试样中加入30 mL三氯甲烷，全部移入分液漏斗后充分摇匀，并静置，待完全分层后，收集下相，再用三氯甲烷萃取3-4次，合并下相，并用无水Na2SO4脱水干燥，放入烘箱中60℃烘干冷却后称重，以不加菌株的处理为空白对照，计算降解率，每组试验3个平行，取平均值。

降解率 =［（m0-m1）÷m0］×100%

m0：对照组的残油重量（g）；m1：降解后样品的残油重量（g）。

1.2.7 高效菌群的构建 采用九因素三水平的方式通过正交实验进行菌群构建。将9种菌设为9种因素，每种菌设置3个接种量（0、0.5、1）作为三水平。将各个菌株分别接入NA液体培养基，直至OD600为1。称取0.2 g固体原油，放入装有80 mL GJ培养基的150 mL三角烧瓶，121℃高温杀菌20 min。将各个菌体按照构建组合和比例分别接入培养基中，各个构建和组合均做3组平行。在30℃，150 r/min的振荡培养箱中降解7 d，测定原油降解率。选出最佳降解菌群。

2 结果

2.1 高效菌株的分离纯化

对所采集的样品经过富集培养以及初筛，分离纯化得到9株微生物，分别编号为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7、SF8和 SF9， 且 发 现 菌 株SF1、SF2、SF7、和SF9的菌株生长较快，菌落形态较大，如图1所示。

2.2 DCPIP筛选高效菌株

用DCPIP对上述分离的9株微生物进行显色筛选。由图2可知，所有菌株在经过不同的时间后，DCPIP由蓝色完全转变为无色，说明这9株菌株对石油有较强的降解能力，在图2-A中，菌株SF3、SF7、SF8在24 h后由蓝色变为无色，在图2-B中菌株SF1、SF2、SF9在48 h后由蓝色变为无色，而图2-C中而菌株SF4、SF5、SF6在72 h后蓝色变为无色，在未添加微生物的离心管，DCPIP未变色。Varjani Sunita等用该方法从石油污染的土壤和水中分离出6株石油降解菌株，最短120 h内可使DCPIP由蓝色变为无色。这是因为石油、多环芳烃以及烷烃等碳氢化合物的降解氧化情况可用氧化还原指示剂DCPIP 进行评估，其主要功能在于可灵敏地反应碳氢化合物初步氧化过程。通常 DCPIP 在氧化态时呈深蓝色，将其添加至微生物降解石油的培养基中，其作为电子受体接受碳氢化合物氧化时所产生的电子从而变为无色。

图1 原油降解菌株的菌落形态Fig.1 Colony morphology of crude oil-degrading strains

图2 DCPIP定性筛选原油降解菌株Fig.2 Qualitative screening of crude oil-degrading strains by DCPIP

2.3 高效菌株的序列比对及系统发育树的构建

对分离筛选得到的9株微生物进行DNA的提取，并进行PCR扩增且测序，序列经NCBI中的blast比对分析，筛选菌株与相似菌株的同源性都高达95%以上，鉴定 SF1为中间苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium），SF2 为肠杆菌（Enterobacter sp.），SF3为不动杆菌（Acinetobacter sp.），SF4为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），SF5为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），SF6假单胞菌（Pseudomonas sp.），SF7为 醋 酸 钙 不 动 杆 菌（Acinetobacter calcoaceticuspartial sequence），SF8为 霍 氏 肠 杆 菌（Enterobacter hormaecheipartial sequence），SF9 为松嫩平原假单胞菌（Pseudomonas songnenensis）。并将这些菌株基于16S rRNA序列的进化树分析。由图3所示，系统发育树自展值均大于85%，证明该系统发育树可信度高。

2.4 原油降解试验及降解率的测定

将9株微生物的发酵液，按10%的接种量接入以石油为唯一碳源的无机盐培养基中，进行摇瓶降解试验，7 d后，结果如图4所示：与对照相比，添加微生物的油膜消失，并将原油分解成小油滴，且原油的贴壁力有不同程度的下降，说明此微生物能利用原油为碳源作为营养物质，将大分子原油降解成小分子，或分解成二氧化碳和水。从图5可知，菌株中间苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）SF1降解能力最强，降解率达48.73%，菌株肠杆菌（Enterobacter sp.）SF2、醋酸钙不动杆菌SF7（Acinetobacter calcoaceticus）、松嫩平原假单胞菌SF9（Pseudomonas songnenensis）的降解能力略低于菌株SF1，降解率分别为41.90%、45.35%、32.25%，其他菌株的降解率也高于20%。

2.5 高效菌群的构建

由正交实验设计，得到了27种菌群组合。通过不同混合菌群对原油的降解试验效果可以得出，有的混合菌群的降解效果优于单个菌株的降解效果。这可能是因为菌株之间存在一定的协同作用，促进降解石油烃相关酶的活性，而也有混合菌群的降解能力低于单个菌株的降解效果，这可能是菌株之间的竞争抑制作用造成的。由表1可以得到菌株间的最佳组合形式以及菌株之间的添加比例，从实验结果可以看出组合9的降解效果最好，对原油的降解率高达57.88%，最低的降解效率是组合18也就是空白实验，原油降解效率为2.50%。组合9是为最佳高效菌群，由菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量为2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2 组成。

图3 原油降解菌株16S rRNA基因序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of crude oil-degrading strain

图4 摇瓶发酵降解原油试验Fig.4 Crude oil degradation experiment by shaking flask fermentation

3 讨论

图5 不同菌株对原油的降解率Fig.5 Degradation rate of crude oil by different strains

目前，国内外研究学者已获得原油降解菌株有100多个属，200个种［21］。本研究获得的不动杆菌属、假单胞菌属和肠杆菌属是常见的原油降解菌株［22］，并且大量研究表明不动杆菌属和假单胞菌属、肠杆菌属对轻质原油具有很好的降解效果［23-25］。不动杆菌属细菌对石油烃中烷烃的降解效果最好，降解烷烃一般通过脂肪酸 β氧化［26］；而假单胞菌属细菌则对芳香烃的降解效率较高［27］，国内外对肠杆菌属在降解原油机理方面的报道相对较少。蓝慧等［28］分离的肠杆菌属在pH 8.91、NaCl 浓度为1.19%、温度为36.78℃以200 r/min的条件下对含油量为1%的培养基振荡处理7 d后，对原油的降解率34.60%，而本文筛选的肠杆菌属对原油的降解率高达41.90%，优于蓝慧等分离的肠杆菌属，可能是由于pH和含氧量的不同直接影响到了微生物的生长，从而间接的影响到石油烃的降解；温度的改变可以使石油污染物的黏度和溶解性发生变化，也能影响到微生物的生长状况和其体内的酶活性，从而影响石油的整个降解过程。周婷等［29］分离的不动杆菌属在30℃、150 r/min的条件下对4 g/L的原油培养基培养15 d后，该菌株对原油的降解率达42.15%，与本研究筛选的不动杆菌属相比，本研究筛选的不动杆菌更有利于原油的降解，因为本研究在30℃、150 r/min的条件下，处理7 d后，对原油的降解率高达45.35%，因此本研究筛选的不动杆菌更有利于原油的降解。中间苍白杆菌属对原油的降解报道不是很常见，尤其对相对密度大的原油降解报道罕见。高鹏飞等［30］从炼油废水中筛选出的一株高效降解石油烃菌株苍白杆菌（Ochrobactrum ciceri），该菌株对含柴油浓度为4 000 mg/L的无机盐培养基在120 r/min、30℃下振荡处理6 d后，结果显示，石油烃降解率高达98.98%。本实验分离的苍白杆菌属SF1在2.5 g/L的原油培养基中7 d后，对原油的降解率为48.37%。从降解率看高鹏飞等筛选的苍白杆菌属对原油的降解效果优于本实验筛选得到的苍白杆菌属，但柴油属于轻质原油，黏度比稠油小，更易于微生物的降解。

表1 高效菌群对原油的降解率Table 1 Degradation rate of high-efficiency bacteria on crude oil

自然环境中的微生物多种多样，石油的降解是一个极为复杂的过程，单个菌株很难实现原油组分的全部降解，构建高效菌群可以结合各单个菌株的降解能力而形成一个较完整的降解体系，发挥菌株间的协同作用，实现对原油的高效降解［31-32］。本研究通过正交实验设计得到最佳高效菌群的构建，结果 表 明， 菌 株 SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量为2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2组成的菌群对原油的降解效果优于单个菌株，降解率达57.88%。而王海峰等［33］将分离得到的16株稠油降解菌株（红球菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属等）进行等比列混合，对含油量1 000 mg/L的培养基处理7 d，结果显示，该混合菌群对稠油的降解率为68%，该菌群对原油的降解效果优于本研究构建的高效菌群。可能是因为菌株的种类、比列及含油量的不同导致的，若含油量过高，使C∶N∶P值失衡，造成营养物质缺乏，影响菌株的生长，进而影响对原油的降解；也有可能原油浓度过大时，阻隔了菌体与氧气的接触，导致菌体不能良好的生长，从而使降解率下降。

4 结论

本研究从原油污泥、实验室自有菌株以及原油污染的土壤中分离筛选出9株微生物，分别为SF1中间苍白杆菌属（Ochrobactrum intermedium），SF2、SF8属于肠杆菌属（Enterobacter sp.），SF3、SF7为不动杆菌属（Acinetobacter sp.），SF4、SF5、SF6、SF9属于假单胞菌菌属（Pseudomonas sp.）。通过对2.5 g/L的原油进行摇瓶实验发现，苍白杆菌 属（Ochrobactrum intermedium）SF1降 解 能 力最强，降解率达48.73%，肠杆菌属（Enterobacter sp.）SF2、 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 SF7（Acinetobacter calcoaceticus）、松嫩平原假单胞菌SF9（Pseudomonas songnenensis）的降解能力略低于菌株SF1，降解率分别为41.90%、45.35%和32.25%，其他菌株的降解率也高于20%。根据正交实验设计得出，菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和 SF9且 添加量为2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2组成的高效菌群的降解效果优于单个菌株的降解效果，降解效果高达57.88%。