石灰对灵芝覆土连作障碍的防控作用及其微生物群落分析

袁源 黄海辰 李琳 刘国辉 傅俊生 吴小平

（1. 福建农林大学生命科学学院，福州 350002；2. 福建农林大学菌物研究中心，福州 350002；3. 仙芝科技（福建）股份有限公司，福州 353400）

灵芝（Ganoderma lingzhi）又名灵芝草，是一种珍贵的食药用菌，最早记载于《神农本草经》，素有“仙草”的美誉［1-2］。其子实体富含灵芝多糖、麦角甾醇和灵芝酸等有效成分，具有良好的保肝、抗肿瘤、降血糖以及免疫调节等生物学功效，在医疗保健市场深受广大消费者的认可［3］。然而，野生灵芝资源十分有限，难以满足市场日益增长的供应需求，人工栽培灵芝就显得尤为重要。迄今为止，灵芝在国内的人工栽培历史已有60余年，主要的栽培方式包括袋料栽培和段木栽培［4］。其中，灵芝段木覆土栽培是一种常见的段木栽培模式，覆土能有效的维持灵芝菌棒的温度和湿度，并且子实体肥大，营养品质较佳［5］。然而，该模式下灵芝连续栽培2-3年后容易发生连作障碍现象，呈现出子实体畸形、病虫害多和产量急剧下降等问题，不利于灵芝产业的健康发展［6］。研究表明，灵芝连作障碍与覆土中微生物群落及其数量的变化具有很强的关联性［2，5，7］。在灵芝连作期间，覆土理化性质改变、土壤反应异常以及灵芝自毒作用等均会引起覆土中微生物群落发生变化，往往表现为覆土中病原真菌逐年增加，而部分有益菌逐渐减少，进而导致大面积的灵芝基地不得不停用［7］。前期实验室对灵芝连作覆土中的真菌群落进行分析，发现青霉属真菌的相对丰度在连作4年的灵芝覆土中比邻近沙壤土约增加了57.92%［8］。因此，如何对灵芝连作覆土进行科学有效的治理就显得尤为重要。

石灰消毒法是一种常见的土壤消毒方法，在改善土壤的酸碱度、重金属沉积以及微生物的组成结构等方面发挥着重要的作用［9-11］。其中，唐明等［12］发现石灰能显著降低烟草酸性土壤中真菌数量，增加土壤中细菌和放线菌的数量，从而有效促进植株的生长。类似地，Shen等［13］采用Illumina测序发现石灰能有效增加烟草根际土壤细菌群落的丰富度和多样性，其可能通过抑制糖化菌、气微菌属和假黄单胞菌属等微生物来缓解烟草的连作障碍问题。王一鸣等［14］发现石灰联合碳铵处理香蕉连作土壤显著降低土壤中变形菌门和子囊菌门相对丰度，且显著提高放线菌门相对丰度，能有效改善香蕉的连作障碍现象。同时，ITS1和16S rDNA扩增子测序技术分别是研究土壤真菌和细菌群落多样性的基本手段之一，常用于反映不同样本中微生物群落的组成结构和种间差异，具有高通量、准确灵敏以及高效快捷等特点［15］。故而本研究将石灰应用于探索灵芝连作障碍，加之扩增子测序技术，将灵芝的产量和覆土中微生物群落的变化有机联系起来，旨在为灵芝连作障碍的生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株为赤芝119（沪农灵芝1号），由上海市农业科学院食用菌研究所认定。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验基地位于仙芝科技（福建）股份有限公司有机灵芝博览园（福建省南平市浦城县，28°01-N，118°32-E），土壤类型为沙壤土，pH呈弱酸性（5-6）。试验于2019年2月27日实施石灰治理连作4年覆土试验，设定4个分组，分别记为CK、LI45、LI90和LS90组，详见表1。每个分组150 m2大棚分别栽培100棒灵芝，将同一批生长状态良好的灵芝脱袋处理后，待菌丝长满段木埋入不同处理的连作4年覆土中，进一步对其进行出芝管理。在此期间，大棚内的光照、温度和湿度等均保持一致。

1.2.2 土壤采集 灵芝连作覆土于2019年10月9日取自有机灵芝博览园。采用S形取样法，按照半径15-20 cm、深度0-5 cm的范围对其进行取样，每个分组取5个点的混合土样。每个分组土样大约重100 g，采集后立即将土样标记并置于冰盒带回实验室，于-20℃低温保存待测。

表1 不同石灰处理方式Table 1 Different lime treatment methods

1.2.3 土壤总DNA的提取 参照土壤DNA提取试剂盒说明书，对覆土样品的进行DNA提取，采用核酸微量测定仪和2%琼脂糖凝胶电泳对所获得的总DNA进行定量和质检［16］。

1.2.4 PCR扩增及测序 真菌采用的引物ITS-1FI2 GAACCWGCGGARGGATCA和ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC对ITS1区域进行PCR扩增［17］。相应的，细菌以16S rDNA可变区（V3+V4）为目标区域进行引物设计，引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）［18］。PCR 扩增体 系为 ：12.5 μL 2×Master Mix、2.5 μL 正向引物、2.5 μL 反向引物、50 ng DNA模板、25 μL ddH2O。PCR反应条件为：98℃ 30 s；98℃ 10 s、54℃ 30 s、72℃ 45 s（35 个循环）；72℃ 10 min、4℃保存。扩增完成后，对PCR产物通过进行回收和纯化。采用Picogreen dsDNA Assay Kit 双链DNA定量检测试剂盒在Qbit荧光定量系统上对上述纯化后的PCR产物文库进行定量。将浓度＞2 nmol/L的文库进行梯度稀释、混合和变性处理。在MiSeq测序仪上，将变性获得的单链使用MiSeq Reagent Kit试剂盒进行长度为2×300 bp的双端测序。

1.2.5 生物信息学分析流程 样品由杭州联川生物技术股份有限公司（LC-Bio）在Illumina NovaSeq平台上按照制造商的建议进行测序。根据双端序列的重叠区，采用Pear将R1和R2序列拼接成长的tag序列，并使用cutadapter去除barcode以及引物序列。然后采用Fqtrim（v0.94）过滤低质量序列，采用Vsearch（v2.3.4）软件过滤嵌合体。使用QIIME2软件的DADA（2Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2）进行降噪后，得到特征表和特征序列feature。Alpha多样性和Beta多样性通过抽平（将所有样本的序列数抽取至最少序列样本的序列数）的方式来进行归一化，物种注释使用相对丰度来进行归一化处理（X菌群count/总count）。Alpha多样性以及Beta多样性均由QIIME2进行流程分析，图片由R（v3.5.2）包绘制。物种注释采用QIIME2的插件feature-classifier进行序列比对，真菌比对数据库为SILVA和unite数据库，细菌为SILVA和NT-16S数据库。其他的图是使用R包实现的（v3.5.2）。

1.2.6 指标测定方法 在灵芝出芝期，同时对各分组灵芝的生长状态和出芝率进行统计。在灵芝成熟期，相应的统计灵芝的生长状态和病害发生情况，具体测定方式如下：

出芝率=（出芝袋数/菌袋总数）×100%

病害率=（存在病害的子实体袋数/菌袋总数）×100%

1.2.7 数据统计学分析 基于feature丰度表，Alpha多样性采用SPSS17.0软件对测序数据进行显著性分析，计量资料数据用x±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01差异极显著。其中，Observed_species指数常用来反映样本的物种丰富度，Simpson指数体现样本中不同物种的多样性。Beta多样性采用R软件vegan包进行PCA（principal component analysis）分析，通过PCA图可直观反映组内生物学重复的相似性及组间差异性，样本的物种组成越相似，则在PCA图中的距离越近。LEfSe差异分析首先采用Kruskal-Wallis秩和检验检测所有的特征物种，通过检测不同组间的物种丰度差异，获得显著性差异物种。其次，利用Wilcoxon秩和检验检测获得的显著性差异物种的所有亚种是否都趋同于同一分类水平。最后，使用线性判别分析（LDA），得到最终的差异物种biomarker。网络互作图和Sparcc热图采用SPSS17.0软件对相对丰度top20的微生物菌群进行相关性性和显著性分析，并使用相关性绘制出网络图以及热图。

2 结果

2.1 石灰处理对出芝生长的影响

为了探究不同石灰处理方式对灵芝出芝和生长的影响，分别对4组灵芝的出芝率和长势进行比较。如图1-A和1-B所示，相比对照组而言，LI90组灵芝长势明显较好且出芝率显著性提高，高达76.00%，相比对照组大约提高了68.89%，而LI45组和LS90组灵芝出芝率有所提高，但不具备显著差异性，表明LI90组石灰浸泡处理灵芝连作覆土对灵芝出芝率具有显著的促进作用。

图1 灵芝初期生长情况分析Fig.1 Analysis of initial growth of G. lingzhi

2.2 石灰处理对灵芝产量的影响

相应的，通过比较灵芝子实体干品质量和生长情况以探究不同石灰处理方式对灵芝产量的影响。如图2-A和2-B所示，不同石灰处理方式下灵芝产量与出芝率变化趋势一致。LI90组灵芝产量比对照组提高了135.87%，具有极显著的差异性，且灵芝生长状况较好，而LI45组和LS90组灵芝产量无显著性提高。其中，LI45组产量略高于LS90组，且灵芝长势较LS90组好。表明LI90组石灰浸泡灵芝覆土能有效提高灵芝的产量，且作用效果最佳。

图2 灵芝后期生长情况分析Fig.2 Analysis of later growth of G. lingzhi

2.3 石灰处理对灵芝病害的影响

如图3所示，通过比较不同分组灵芝的病害发生情况，发现对照组灵芝病害率最高，达到51.51%。LI45、LI90和LS90组灵芝病害率与对照组相比均有所下降，分别为26.26%、23.23%和34.34%。其中，LI90组灵芝病害率比对照组大约降低了54.90%，具有显著性差异。综上，石灰浸泡处理整体上比石灰匀撒处理灵芝连作覆土对灵芝连作障碍的改善效果更好，并且LI90组石灰浸泡处理灵芝连作覆土在改善灵芝出芝率、产量、病害率和长势方面作用效果显著。因此，实验进一步对石灰浸泡处理的灵芝覆土微生物群落进行分析，以期为石灰浸泡处理连作覆土在防控灵芝连作障碍方面奠定基础。

图3 灵芝病害率统计与分析Fig.3 Statistics and analysis of G. lingzhi disease rate

2.4 覆土中真菌多样性分析

为了深入探究石灰浸泡处理对连作覆土中真菌群落的影响，采用ITS1测序对CK、LI45和LI90组覆土真菌群落进行测序。如图4-A所示的feature分布维恩图，3个分组一共获得310个feature。其中，3个分组中共有的feature为76个，特有的feature依次为59、45和80。发现LI45组特有的feature数目最少，LI90组特有的feature数目最多，表明LI45组特有真菌较少，LI90组特有真菌较多。如图4-B所示，通过对覆土中真菌群落进行PCA分析，发现CK组和LI45组样品距离较近，而与LI90组距离相对较远，表明对照组与LI45组覆土中真菌群落组成较为相似，而与LI90组间差异较大。如图4-C所示，覆土中真菌群落的Observed_species指数分析发现LI90组真菌物种的丰富度相比对照组显著提高，LI45组无明显变化。如图4-D所示，覆土中真菌群落的Simpson指数分析发现LI90组真菌物种多样性显著降低，表明LI90组与对照组中真菌物种的丰富度和多样性差异较大。

图4 真菌feature分布维恩图与α和β多样性分析Fig.4 Venn diagram of fungal feature distribution and analysis of α and β diversity of fungi

2.5 真菌组成结构分析

从CK、LI45和LI90组9个样品中一共获得48种真菌，分别隶属于3门、11纲、27目、35科和42属。其相对丰度位列前20的真菌属如图5-A所示。其中，担子菌门Basidiomycota_unclassified和子囊菌门Ascomycota_unclassified是覆土中的优势菌属，在3个分组中平均约占真菌总序列的99.24%。如图5-B所示，相对对照组组而言，担子菌门Basidiomycota_unclassified相对丰度在LI45和LI90组中明显增加，子囊菌门Ascomycota_unclassified相对丰度明显降低，并且二者在LI45组中变化更为显著。另外，Agaricomycetes_unclassified的相对丰度在LI45和LI90组明显提高，并且其相对丰度的增加呈浓度依赖性，而Wallemia节担菌属、Trichosporon丝孢酵母属、Hyphodontia中国产丝齿菌属等担子菌门真菌属的相对丰度反而下降。Microascaceae_unclassified、Mycosphaerella球腔菌属、Glomerella小丛壳属、Eurotium散囊菌属、Devriesia德福里斯孢属、Gibellulopsis的相对丰度在LI45组和LI90组中较对照组降低，并且球腔菌属和小丛壳属相对丰度的降低呈剂量依赖性。子囊菌门Aspergillus曲霉属相对丰度在LI45组较对照组明显提高，在LI90组略有下降。表明石灰浸泡处理灵芝连作覆土能改变覆土中真菌物种组成结构，主要表现为子囊菌门相对丰度的降低和担子菌门相对丰度的增加。

图5 属水平真菌群落的相对丰富度Fig.5 Relative abundance of fungal communities at genus level

2.6 真菌多水平LEfSe物种差异分析

覆土中真菌LEfSe物种差异分析发现（图6），CK和LI45组土壤样品中一共有23个分类水平的真菌物种存在显著的差异。CK组中子囊菌未知纲g__Ascomycota_unclassified、子囊菌未知目f__Ascomycota_unclassified、子囊菌未知科o__Ascomycota_unclassified、子囊菌未知属c__Ascomycota_unclassified、子囊菌p__Ascomycota；LI45组中伞菌纲c__Agaricomycetes、伞菌未知目g__Agaricomycetes_unclassified、伞菌未知科f__Agaricomycetes_unclassified、伞菌未知属o__Agaricomycetes_unclassified、担子菌未知纲g__Basidiomycota_unclassified、担子菌未知目f__Basidiomycota_unclassified、担子菌未知科o__Basidiomycota_unclassified、担子菌未知属c__Basidiomycota_unclassified、担子菌p__Basidiomycota、真菌未知纲g__Fungi_unclassified、真菌未知目f__Fungi_unclassified、真菌未知科o__Fungi_unclassified、真菌未知属c__Fungi_unclassified和p__Fungi_unclassified等是灵芝连作4年覆土与22.5 kg石灰处理覆土真菌群落差异的主要类群。同时，CK与LI90组土壤样品真菌物种无显著性差异。

2.7 真菌相关性分析

在CK、LI45和LI90组中，属水平上真菌物种网络互作图如7-A所示。子囊菌门未知属Ascomycota_unclassified与担子菌门未知属Basidiomycota_unclassified以及中国产丝齿菌属Hyphodontia与德福里斯孢属Delvriesia之间均呈显著的负相关。同时，如相关性热图7-B所示，蓝色表示正相关，红色表示负相关。子囊菌门未知属与担子菌门未知属间具有较强的负相关，表明灵芝连作覆土中子囊菌门未知属越多，担子菌门未知属的相对丰度就越低。

2.8 覆土中细菌多样性分析

采用16S rDNA测序对CK、LI45和LI90组覆土细菌群落进行测序，以分析石灰浸泡处理对连作覆土中细菌群落的影响。如图8-A所示，3个分组一共获得532个feature。其中，3个分组中共有的feature为160个，特有的feature为97、82和101。发现LI45组特有的feature数目最少，LI90组特有的feature数目最多，表明LI45组中特有的细菌较少，而LI90组中较多。类似的，如图8-B所示的PCA分析图，发现对照组与LI45组细菌物种组成较为相似，而与LI90组差异较大。此外，如图8-C所示，对Observed_species指数分析表明覆土中细菌物种丰富度在3个分组之间无显著变化，Simpson指数发现3个分组的细菌物种多样性无显著差异性，表明石灰浸泡处理对连作覆土中细菌物种丰富度和多样性无显著影响。

2.9 细菌组成结构分析

从9个样品中一共获得216种细菌，分别隶属于6门、11纲、31目、51科和101属。如图9-A所示，变形菌门是覆土中的优势菌门，约占细菌总序列的96.70%，并且相对丰度前20的细菌属均隶属于变形菌门。如图9-B所示，LI45和LI90组Azospirillum固氮螺菌属、Zoogloea动胶菌属、Methylobacillus甲基菌属、Methylophilus嗜甲基菌属、Cupriavidus贪铜菌属、Diaphorobacter、Acidovorax嗜酸菌属、Burkholderiaceae_unclassified的相对丰度均有所提高。其中，LI45和LI90组较对照组，动胶菌属、甲基菌属和嗜甲基菌属的相对丰度极显著提高。并且甲基菌属、嗜甲基菌属、贪铜菌属、Diaphorobacter、嗜酸菌属、Burkholderiaceae_unclassified相对丰度的提高呈剂量依赖性。同时，Rhodobacter红细菌属、Acinetobacter不动杆菌属、Pseudomonas假单胞菌属、Flavobacterium黄杆菌属、Shinella申氏杆菌属、Comamonas丛毛单胞菌属、Sphingomonas鞘氨醇单胞菌属和Sphingobium鞘脂菌属相对丰度在LI45和LI90组有所下降。其中，鞘氨醇单胞菌属和鞘脂菌属在LI45和LI90组极显著下降。并且鞘氨醇单胞菌属、鞘脂菌属、红细菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、申氏杆菌属的相对丰度的下降呈剂量依赖性。此外，在LI90组中Alicycliphilus相对丰度较对照组明显提高，而在LI45组中反而下降。表明石灰浸泡处理不仅有效降低灵芝连作覆土中子囊菌门真菌属的相对丰度，同时显著提高了连作覆土中多种变形菌门细菌群落的相对丰度。

图6 覆土中真菌LEfSe物种差异分析Fig.6 Analysis of the difference of the fungal LEfSe species in the covering soil

2.10 细菌多水平LEfSe多级物种差异分析

图7 覆土中真菌相关性分析Fig.7 Correlation analysis of fungi in the covering soil

覆土中细菌LEfSe物种差异分析发现（图10），CK、LI45和LI90组土壤样品中一共有22个分类水平的细菌存在显著的物种差异。其中，CK组中鞘脂菌属g__Sphingobium、鞘氨醇单胞菌科f__Sphingomonadaceae、鞘氨醇单胞菌目o__Sphingomonadales、丛毛单胞菌属g__Comamonas等；LI45组中动胶菌属g__Zoogloea和红环菌科f__Rhodocyclaceae等 ；LI90组 中 g__Pseudopedobacter、嗜酸菌属g__Acidovorax、伯克氏菌目o__Burkholderiales、β-变形菌纲c__Betaproteobacteria等是灵芝连作4年覆土、22.5 kg石灰处理覆土和45 kg石灰处理覆土细菌群落差异的主要类群。

图8 细菌feature分布维恩图与α和β多样性分析Fig.8 Venn diagram of bacterial feature distribution and analysis of α and β diversity of bacteria

2.11 细菌相关性分析

如图11-A所示，由属水平上细菌物种网络互作图可发现，在CK、LI45和LI90组中甲基菌属和贪铜菌属、贪铜菌属和嗜酸菌属、不动杆菌属和甲基菌属、鞘脂菌属和丛毛单胞菌属、鞘脂菌属和假单胞菌属、假单胞菌属和黄杆菌属之间呈显著的正相关；鞘脂菌属和动胶菌属、鞘脂菌属和贪铜菌属、贪铜菌属和丛毛单胞菌属、Pandoraea和Aquamicrobium、假单胞菌属和贪铜菌属、固氮螺菌属和Comamonadaceae_unclassified之间呈显著的负相关。同时，贪铜菌属、鞘脂菌属、假单胞菌属菌群的丰富度较其他优势菌群高。如11-B所示，Pandoraea和Aquamicrobium、鞘脂菌属和贪铜菌属之间负相关性较强。不动杆菌属和甲基菌属、甲基菌属和贪铜菌属、贪铜菌属和嗜酸菌属、假单胞菌属和黄杆菌属、鞘脂菌属和假单胞菌属之间正相关性较强。其中，不动杆菌属和甲基菌属、甲基菌属和贪铜菌属、贪铜菌属和嗜酸菌属相对丰度显著增加，假单胞菌属和黄杆菌属、鞘脂菌属和假单胞菌属相对丰度显著下降。

3 讨论

图9 属水平细菌群落的相对丰富度Fig.9 Relative abundance of bacterial communities at genus level

近年来，灵芝在健康产业领域展现出得天独厚的药用优势，深受大众的喜爱，但是严峻的连作障碍问题长期影响着段木覆土栽培灵芝的农业生产。为了缓解灵芝连作障碍问题，目前生产上主要采用轮作对灵芝覆土进行修复。如祝宁等［19］采用大棚草莓基质育苗和灵芝栽培进行轮作，能有效减少土壤病害的发生。然而，灵芝栽培与其他作物轮作周期较长，导致大量灵芝基地无法正常使用，不利于灵芝产业的良性发展。因而，众多学者致力于灵芝连作障碍的生物防控研究。如马红梅等［20］提出采用生物防治和和林间仿野生栽培等防治措施。吴晓明等［5］采用高温液氨熏蒸对灵芝连作覆土消毒，该方法能有效提高灵芝的生长速度和产量，并消灭覆土中杂草和绿色木霉等真菌。研究发现灵芝的甲醇提取物在体外实验中对黑曲霉、黄曲霉和青霉菌等病原真菌也有良好的抑菌活性［21］。文冬华等［22］使用1%生石灰水预防木霉等病害，经过观察和统计作用效果明显。相应地，本研究采用石灰消毒法对灵芝连作覆土进行处理，其成本低、周期短、效果显著并且操作简单，有助于缓解灵芝连作障碍引发的农业问题。

图10 覆土中细菌LEfSe物种差异分析Fig.10 Analysis of the difference of the bacterial LEfSe species in the covering soil

研究结果发现，石灰浸泡处理组灵芝长势较好，不仅提高了灵芝出芝率和子实体干品产量，而且显著降低灵芝病害率，有效改善了灵芝连作障碍现象。其中，LI90组作用效果更为显著。微生物在连作覆土中呈现出现由“细菌型”转向“真菌型”的趋势，即细菌数量大幅减少，真菌数量急剧增加［7］。灵芝覆土中真菌测序结果表明，子囊菌门相对丰度在LI45和LI90组中明显降低，担子菌门相对丰度明显增加，并且子囊菌门未知属和担子菌门未知属的相对丰度呈负相关。马红梅等［7］基于灵芝覆土中优势菌群对灵芝菌丝体的化感效应，发现曲霉属、木霉属、青霉属和链孢霉属等子囊菌门真菌是灵芝连作覆土中主要的病原菌。本研究结果同样发现子囊菌门Aspergillus曲霉属相对丰度在LI90组略有下降，在LI45组较对照组明显提高，推测LI90组石灰浸泡处理能有效降低覆土中子囊菌门曲霉属等病原真菌，从而有效降低灵芝的病害率。细菌作为土壤生态系统的重要组成部分，在促进土壤物质循环利用和生物修复方面发挥着重要的作用［23］。覆土中细菌相关性分析结果表明，在CK、LI45和LI90组覆土中，贪铜菌属、鞘脂菌属和假单胞菌属菌群的丰富度高于其他具有物种差异的菌群。其中，贪铜菌属的相对丰度呈剂量依赖性提高，鞘脂菌属和假单胞菌属的相对丰度呈剂量依赖性降低。并且贪铜菌属和甲基菌属、嗜酸菌属的相对丰度呈正相关。研究发现贪铜菌属和嗜酸菌属可以降解环境中芳香类和酚类等多种有机物，对环境修复具有重要意义，这些细菌类群在连作障碍方面的生态作用有待进一步研究［24-26］。因此，以上数据表明LI90组显著提高灵芝的出芝率、产量，降低灵芝的病害率可能与灵芝覆土中子囊菌门曲霉属等病原真菌相对丰度的减少，以及变形菌门贪铜菌属和嗜酸菌属等多种有益细菌的相对丰度的增加有关，以期为灵芝的连作障碍的防控提供依据。

图11 覆土中细菌相关性分析Fig.11 Correlation analysis of bacteria in the covering soil

4 结论

LI90组石灰浸泡处理连作覆土能有效改善灵芝连作障碍现象，可作为防控灵芝连作障碍的一个有效措施，其作用机理可能与灵芝覆土中子囊菌门曲霉属等相对丰度的下降，以及变形菌门贪铜菌属等相对丰度的增加有关。