香稻品种OsBADH2突变位点分析及其功能标记的开发

孙平勇 张武汉 舒服 何强 张莉 彭志荣 邓华凤，3

（1. 湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点实验室，长沙 410125；2. 湖南省核农学与航天育种研究所，长沙 410125；3. 湖南省农业科学院，长沙 410125）

水稻是重要的粮食作物之一，杂交水稻的发展为解决我国人民的温饱问题作出了巨大贡献。随着国家经济的飞速发展、农业生产力的不断提升，我国居民实现了由过去吃不饱到现在吃得好的历史性转变。香稻不仅具有浓郁的香味，而且富含多种维生素和芳香氨基酸，有很高的营养价值［1］，深得国内外消费者的喜爱。传统的香稻品种产量低，导致香米的价格是普通大米的2-3倍［2-3］。因此，香味作为水稻的重要品质性状，越来越受到育种专家的重视。明确水稻香味遗传的分子机理有助于培育香稻新品种。

近年来，测序技术、基因编辑和分子生物学的飞快发展，促进了水稻香味基因的克隆及其分子机理的解析。水稻OsBADH2（LOC_Os08g32870）是一个重要的香味调控基因。早在1992年，康奈尔大学的Tanksley团队将香味隐性基因OsBADH2初步定位在水稻第8染色体上，与RFLP标记RG28的遗传距离为4.5 cM［4］，后来通过不同的遗传群体将其定位在标记RG28的附近［5-7］。直到2005年，澳大利亚Bradbury才将OsBADH2精细定位在SSR标记RM515和SSRJ07之间386 kb的区间，并通过测序分析成功预测到候选基因［8］。OsBADH2的编码蛋白为甜菜碱醛脱氢酶，香稻OsBADH2第7外显子存在8 bp的缺失和3 bp的替换，导致其蛋白功能丧失，从而使籽粒积累香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）［8］。功能互补和 RNAi等转基因方法证实了OsBADH2的功能［9-10］。研究表明，OsBADH2第7外显子的8 bp缺失是主要的变异类型［11］，之后在第 1、2、10、12、13和 14外显子以及第4和第5外显子之间、第1外显子和第1内含子的剪接位点、5′UTR区发现一系列新的等位突变类型［3，12-17］。这些等位基因的发现，为培育优质香稻品种提供了重要的基因资源。

目前，OsBADH2不同的等位变异相继被报道，但通过质谱仪定量比较它们之间香味表型差异的甚少。本研究通过对10份香稻OsBADH2编码区进行测序，发现其中9份香稻第7外显子缺失8 bp和替换3 bp、1份香稻第14外显子插入1个碱基G。对香味物质2AP含量进行测定，表明OsBADH2不同变异类型的香味有强弱之分。根据第7外显子的变异开发功能标记E7，并对香稻资源和育种群体进行鉴定，为利用OsBADH2培育优质香稻新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香稻品种（品系）10份：巴斯马蒂、香杂1号、玉油香占、象牙香占、花香B、农香24、稻花香、香粳、明香10S和xiao7。非香稻品种（品系）2份：魔王谷和02428。香稻育种群体：泰丰B/明香10S//泰丰B和粳944/稻花香//粳944。

供试材料于2018年和2020年正季种植在湖南杂交水稻研究中心试验田。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增和电泳检测 采用CTAB法提取水稻叶片的基因组DNA。利用擎科生物公司的T3 Super Mix体系进行PCR扩增：98℃ 2 min ；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，35 个循环 ；72℃ 2 min；4℃冷却。反应产物利用1.5%的琼脂糖凝胶检测；或者通过8%的聚丙烯酰胺电泳检测，PCR产物送擎科生物公司测序。扩增OsBADH2编码区的9对引物序列参考Kovach等［11］。

1.2.2 OsBADH2编码区的比对分析 以野生型非香稻日本晴OsBADH2编码区的序列为参考，其全长下载自RGAP数据库（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）。通过Sequencher软件对测序结果进行比对分析，最终获得供试香稻OsBADH2编码区的变异类型。

1.2.3 香味物质2AP含量的测定 委托武汉普奈斯生物科技有限公司测定香味物质2AP的含量。取水稻成熟籽粒并用干冰保存，种子去壳后，于液氮中研磨粉碎，以1∶1的无水乙醇和氯仿萃取样品中的2AP，通过Thermo TSQ 8000 EVO质谱仪进行测定。每个材料设3次生物学重复，通过t测验计算P值分析品种间的显著性差异。

1.2.4 OsBADH2功能标记的设计与合成 根据香稻OsBADH2第7外显子8 bp的缺失，通过Primer Premier5软件设计1对能检测水稻是否具有香味的功能标记E7，其引物序列为E7F：5′-ACCCCATCAATGGAAATG-3′，E7R：5′-CAGGATAGAACTGGCTAC-3′。引物由擎科生物公司合成。

2 结果

2.1 香稻OsBADH2变异类型的分析

为了明确供试香稻的香味是否由OsBADH2的变异造成，对其编码区进行测序分析。利用9对覆盖OsBADH2的引物对样品DNA进行PCR扩增，其产物通过琼脂糖电泳检测。以农香24和稻花香的扩增结果为例，除了第4对引物的扩增产物有非特异性条带，其他产物均为符合目标大小的单一清晰条带（图1），因此适合测序。

图1 OsBADH2 编码区的扩增Fig. 1 Amplification result from coding regions of OsBADH2

测序结果显示，巴斯马蒂、香杂1号、玉油香占、象牙香占、花香B、农香24、稻花香、香粳和明香10S这9个香稻OsBADH2的第7外显子均有8 bp的缺失和3 bp的替换。香稻xiao7的OsBADH2第7外显子与非香稻日本晴的一致，而在第14外显子有1个碱基（G）的插入突变（图2）。

2.2 基于第7外显子8 bp的缺失开发OsBADH2的功能标记

为了通过分子标记辅助选择提高育种效率、培育香稻品种，根据OsBADH2第7外显子的变异开发了功能标记E7，E7的PCR扩增产物覆盖了8 bp的缺失位点（图3）。根据设计原理，利用E7对香稻（有8 bp的缺失）和非香稻的DNA进行扩增时，其产物大小分别为267和275 bp；如果是杂合型，扩增产物则有267和275 bp条带。因此，只需通过1次PCR扩增和电泳检测，即可快速鉴定出OsBADH2的3种基因型。

图2 OsBADH2 的基因结构和香稻的变异类型Fig. 2 Genetic structure of OsBADH2 and allelic variation types in fragrant rice

图3 功能标记E7 在OsBADH2 上的位置Fig.3 Location of functional marker E7 in the OsBADH2

为了验证功能标记E7的准确性，以测序的10份香稻和2份非香稻的基因组DNA为模板进行PCR扩增，并通过8%的聚丙烯酰胺电泳检测。结果显示，在第7外显子有8 bp缺失的香稻巴斯马蒂、香杂1号、玉油香占、象牙香占、花香B、农香24、稻花香、香粳和明香10S的扩增产物大小为267 bp；香稻xiao7在第7外显子没有8 bp的缺失，因此，它的扩增大小为275 bp，与非香稻魔王谷和02428的一致（图4）。PCR扩增结果与预测的结果完全一致，说明开发的功能标记E7能高效检测OsBADH2第7外显子是否有8 bp的缺失。

图 4 功能标记E7 对不同品种OsBADH2 基因型的鉴定Fig. 4 Molecular detection of OsBADH2 genotypes by functional marker E7 in different rice varieties

2.3 不同香稻香味物质2AP含量的比较

为了明确不同等位基因型之间香味物质的含量是否有差异，对OsBADH2第7外显子变异（象牙香占）和第14外显子变异（xiao7）的香稻以及非香稻（魔王谷）的香味物质2AP进行测定。结果表明，非香稻魔王谷的2AP含量最低，只有13.08 ng/g；香稻象牙香占的2AP含量适中，浓度为109.95 ng/g；香稻xiao7的2AP含量最高，达147.68 ng/g。香稻象牙香占和xiao7的2AP含量均显著高于非香稻魔王谷2AP的含量，而xiao7的2AP含量显著高于象牙香占的含量（图5）。

2.4 功能标记E7在培育香稻新品种中的应用

图5 不同品种香味物质2AP含量比较Fig. 5 Content of 2AP in different rice varieties

为了利用功能标记E7辅助选择培育优质香稻新品种，以香稻稻花香和明香10S为香味基因的供体，分别与粳944和泰丰B杂交构建了粳944/稻花香//粳944和泰丰B/明香10S//泰丰B群体。通过功能标记E7对这两份育种群体的OsBADH2基因型进行鉴定，结果显示，稻花香和明香10S的PCR扩增产物大小为267 bp，非香稻粳944和泰丰B的产物大小为275 bp，而杂合型扩增产物包含267和275 bp条带（图6）。基因型统计结果表明，粳944/稻花香//粳944群体的74个单株里有38个杂合，其余为非香型纯合，杂合数与纯合数之比接近1∶1；泰丰B/明香10S//泰丰B群体的41个单株中间有21个杂合，杂合数与纯合数之比也接近1∶1，与预期的分离比一致。因此，设计的功能标记E7可以对OsBADH2非香型显性纯合、香型隐性纯合和杂合3种基因型进行快速准确鉴定。

3 讨论

香稻资源遍布全球，泰国的茉莉香105（KDML105）和印度的巴斯玛蒂（Basmati）都是国际上有名的香稻。我国香稻的种植历史也很悠久，玉针香、螃蟹谷、香禾和靖西香糯分别是湖南、云南、贵州和广西的代表性常规香稻品种。传统的常规香稻因抗性差和植株偏高等原因导致产量低，而杂交香稻具有抗逆性强和产量高的特点［18］。1995年周坤炉［19］利用香稻不育系和非香稻恢复系育成了我国首个杂交香稻组合香优63。由于现有的香味基因属于隐性遗传，因此由香稻不育系和非香稻恢复系配组得到的杂交稻米粒只有1/4具有香味［20］。直到2013年，汤俭民等［21］利用均具香味的不育系和恢复系培育出一个全香型杂交稻红香优68。

图6 功能标记E7 对2 份育种群体OsBADH2 基因型的鉴定Fig. 6 Molecular detection of OsBADH2 genotypes by functional marker E7 in two breeding populations

快速准确地对香味性状进行鉴定是开展香稻育种的前提。传统育种一般通过咀嚼法和KOH浸泡法来鉴定香味［22］，由于香稻的香味受环境条件的影响很大，加之人为因素，增加了其鉴定的难度［23］。此外，由于杂合体不具有香味，以往许多含有香味基因的优良杂合体被淘汰，不利于培育优质香稻新品种。因此急需一种简便、高效和准确鉴定香味基因型的方法。近年来，随着功能基因组学和测序技术的发展，分子标记辅助选择已广泛应用于香稻的遗传育种，大大提高了选择效率、加快了育种进程，许多香稻品种已得到大面积推广［24］。研究人员根据OsBADH2第12外显子3 bp的插入突变，设计了功能标记FME12-3，并利用2 个F2群体证明了FME12-3可以准确快速地鉴定OsBADH2的不同基因型［15］。沈雨民等［25］通过分子标记辅助选择培育出米质优、抗稻瘟病、异交率高和配合力好的不育系赣莲A，具有很好的应用前景。

利用分子标记辅助选育香稻新品种，首先要明确供体香味基因的突变类型，然后根据突变位点开发相应的功能标记。本研究对10份香稻OsBADH2编码区进行测序，发现其中9个香稻OsBADH2的第7外显子均为8 bp的缺失和3 bp的替换，只有1份香稻在第14外显子有1个碱基（G）的插入突变，这两种变异均为以前报道的类型［8，15］。研究表明第7外显子的缺失为主要突变类型，Kovach等［11］在鉴定的117个香稻资源中，有93份在OsBADH2第7外显子缺失8 bp。杨国峰等［26］对12个香稻进行测序，发现其中10个材料在第7外显子具有同样的突变类型。张江丽等［27］鉴定出86份具有香味的水稻资源，其中80份在第7外显子存在缺失。为了明确第7外显子的变异与其他类型的变异是否会导致香味表型的强弱差别，对第7外显子变异（象牙香占）和第14外显子变异（xiao7）的香稻以及非香稻（魔王谷）的香味物质2AP进行测定。结果表明，香稻象牙香占和xiao7的2AP含量均显著高于非香稻魔王谷2AP的含量，而xiao7的2AP含量显著高于象牙香占的含量。这一结果说明不同变异类型香稻的香味表型有强弱之分，同时可以推测第7外显子的突变作为应用最广泛的等位基因型，不是由于该等位基因型的效应最大（即香味物质的积累最多），而是因为这些香味品种具有相同的OsBADH2来源，在育种的过程中被大量选择保留。为了通过分子标记辅助选择提高育种效率、培育香稻品种，本研究根据OsBADH2第7外显子8 bp的缺失开发了功能标记E7，通过对香稻资源和育种群体进行鉴定，证明E7可以对OsBADH2非香型显性纯合、香型隐性纯合和杂合3种基因型进行快速准确鉴定，为利用OsBADH2进行分子育种、培育优质香稻新品种奠定了重要基础。

4 结论

象牙香占、花香B、农香24等9份香稻均在第7外显子发生8 bp的缺失和3 bp的替换，只有香稻xiao7在第14外显子有1个碱基（G）的插入突变。根据香稻OsBADH2第7外显子8 bp的缺失设计的功能标记E7，能快速准确鉴定OsBADH2的纯合显性、纯合隐性和杂合3种基因型。