罗伊氏乳杆菌的抑菌能力及其对肉仔鸡盲肠内容物菌群的影响

刘 滢 刘雪连* 魏秀莲 娄迎霞 李晟硕

1.北京大北农科技集团股份有限公司饲用微生物工程国家重点实验室，北京100192；2.北京市饲料监察所，北京100107

罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是一种存在于人和动物肠道中具有抑制胃肠道病原菌繁殖、调节动物肠道菌群作用的饲用益生菌[1]。随着饲料中促生长类抗生素的禁用，罗伊氏乳杆菌作为饲用微生态制剂开发具有较高的应用价值和市场潜力。雏鸡因生长迅速、消化系统发育不完善、抵抗力弱等生理特点对于养鸡全期的生产性能有重要影响，通过益生菌调节雏鸡盲肠菌群、改善雏鸡体质有助于提升养殖效益[2-5]。本试验通过研究罗伊氏乳杆菌的抑菌能力及添加不同水平的罗伊氏乳杆菌制剂对肉仔鸡盲肠内容物菌群的影响，为罗伊氏乳杆菌制剂在肉仔鸡养殖上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

主要试材：罗伊氏乳杆菌DBN-JP 分离自健康仔猪粪便，保藏于大北农集团饲用微生物工程国家重点实验室；罗伊氏乳杆菌CICC6118、CICC6119、CICC6121 购自中国工业微生物菌种保藏中心；罗伊氏乳杆菌制剂：罗伊氏乳杆菌DBNDBN-JP 活菌数≥5×1011cfu/g，由北京大北农科技集团股份有限公司饲用微生物工程国家重点实验室提供；试验用基础饲粮由北京大北农科技集团股份有限公司提供；硫酸黏菌素为市售。

主要仪器：酶标仪（Epoch，Thermo）。

1.2 检测指标与方法

1）抑菌性能。牛津杯法。

2）试验动物及分组。试验地点在大北农玉田养殖场进行，试验鸡舍及配备的肉仔鸡养殖设备均由该养殖场提供。随机选用体重、健康情况基本一致的1日龄AA 白羽肉仔鸡720 羽，按体重相近、性别比例相同原则随机分为5 组，空白组：饲喂基础日粮；抗生素组：饲喂基础日粮+硫酸黏菌素30 g/t；菌粉组：饲喂基础日粮+罗伊氏乳杆菌菌粉1 kg/t；上清液组：饲喂基础日粮+罗伊氏乳杆菌上清液1 L/t；发酵液组：饲喂基础日粮+罗伊氏乳杆菌发酵液1 L/t。每组6 个重复，每个重复24 羽鸡，试验期42 d，常规饲养，自由采食，日常管理与免疫程序按鸡场常规办法进行。参照NRC 肉仔鸡营养标准配制，前期（1～21日龄）和后期（22～42日龄）日粮成分及营养素水平见表1和表2。料型为粉料，基础日粮中只添加抗球虫药盐霉素（60 μg/mL），不添加其他抗生素。

表1 1～21日龄日粮组成

表2 22～42日龄日粮组成

3）样品采集与处理。于试验第43 天结算饲粮，所有鸡禁食8 h。试验第44 天对所有试验鸡进行称重并记录，每个重复内选取3 羽体重最接近该组平均体重的肉仔鸡并标记，按顺序剪断其颈静脉致死，用卫生棉线分别将盲肠于两端结扎后从外端剪断，置于密闭的样品袋中冰冻保存，迅速带至实验室，以无菌方法取肠道食糜于灭菌离心管中，液氮速冻、放于-80 ℃冰箱中保存待测。

4）盲肠内容物菌群。将含有大肠杆菌、乳酸杆菌和沙门氏菌目的片段的质粒作为标准质粒分别建立各菌群的标准曲线，采用实时荧光定量方法对所有样本拷贝数进行测定，通过标准曲线计算不同微生物的数量。

1.3 统计分析

采用IBM SPASS Statistics 24 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），运用Dun－can’s 法进行多重比较，结果用平均值±标准误差表示，以P<0.05 判断差异显著性。

2 结果与分析

2.1 罗伊氏乳杆菌的抑菌能力

由表3可知，罗伊氏乳杆菌DBN-JP 对大肠杆菌k88 的抑菌能力虽低于0.02%硫酸黏菌素，但显著高于罗伊氏乳杆菌CICC6118、CICC6119 和CICC6121；对金黄色葡萄球菌的抑菌能力与0.02%硫酸黏菌素相比差异不显著，显著高于罗伊氏乳杆菌CICC6118、CICC6119 和CICC6121；对沙门氏菌的抑菌能力与0.02%硫酸黏菌素相比差异不显著，但显著高于罗伊氏乳杆菌CICC6118、CICC6119 和CICC6121。由表4可知，80 ℃加热15 min 对罗伊氏乳杆菌DBN-JP 的抑菌能力影响不显著。

表3 不同样品对致病菌的抑菌能力 mm

表4 加热对罗伊氏乳杆菌DBN-JP 发酵液抑菌能力的影响 mm

2.2 罗伊氏乳杆菌对肉仔鸡盲肠内容物菌群的影响

由表5可知，与空白组相比，上清液组、发酵液组盲肠内容物中大肠杆菌的数量显著降低，菌粉组和发酵液组盲肠内容物中乳酸杆菌数量显著提高，发酵液组盲肠内容物中沙门氏菌的数量显著降低；与抗生素组相比，上清液组、发酵液组盲肠内容物中大肠杆菌数量差异不显著，菌粉组、发酵液组盲肠内容物中乳酸杆菌数显著升高，发酵液组盲肠内容物中沙门氏菌数量差异不显著，菌粉组、上清液组盲肠内容物中沙门氏菌数量显著高于抗生素组。

表5 对肉仔鸡盲肠内容物菌群的影响

3 讨 论

罗伊氏乳杆菌是一种专性异型发酵菌株，其作为一种饲料添加剂菌株具有广阔的发展前景[6]。大量研究[7-9]表明，罗伊氏乳杆菌具有多种生物学功能，尤其在抑制病原菌生长和调节肠道菌群方面发挥重要作用。本研究发现，罗伊氏乳杆菌DBN-JP 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌具有较好的抑菌作用，这与吴惠贞等[10]、朱振军等[11]的研究结果相似；但张紫薇[12]的研究表明，罗伊氏乳杆菌J1 对以大肠杆菌和沙门氏菌为代表的革兰氏阴性菌和以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为代表的革兰氏阳性菌无抑菌效果，这可能与不同菌株产生的抑菌物质的结构和种类具有多样性有关。本研究结果表明，罗伊氏乳杆菌DBN-JP 对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌能力与0.02%硫酸黏菌素差异不显著，对大肠杆菌的抑菌能力略低于0.02%硫酸黏菌素，显著高于对照菌株；乳酸菌的耐热能力直接关系到其产业化，良好的耐热能力有助于乳酸菌在饲料中的添加和应用。一般来说，制备颗粒料的温度一般在75～80 ℃、15 min，本研究发现，80 ℃加热15 min 对罗伊氏乳杆菌DBN-JP 的抑菌能力影响不显著，这说明罗伊氏乳杆菌DBN-JP 发酵液具有较好的耐热能力，更适用于产业化应用需求。

研究[13]发现，罗伊氏乳杆菌具有调节肠道菌群、改善肠道环境、维持动物肠道微生物的菌群平衡等功能。本研究表明，与空白组相比，饲料中添加罗伊氏乳杆菌DBN-JP 上清液和发酵液可以显著降低盲肠内容物中的大肠杆菌的数量，添加发酵液可显著降低沙门氏菌的数量，添加菌粉和发酵液可以显著提高盲肠内容物中乳酸杆菌数量；与抗生素组相比，饲料中添加上清液或发酵液对盲肠内容物中大肠杆菌数量的抑菌效果和添加抗生素差异不大，添加菌粉或发酵液盲肠内容物中乳酸杆菌数显著升高，添加发酵液对盲肠内容物中沙门氏菌数量差异不显著，添加菌粉或上清液对盲肠内容物中沙门氏菌的抑制效果差于抗生素组。这与杨家军等[14]、WALSHAM 等[15]的研究结果相似，说明饲料中添加罗伊氏乳杆菌DBN-JP 菌粉、发酵液或上清液具有抑制肉仔鸡盲肠内容物中大肠杆菌和沙门氏菌，提高乳酸杆菌数量的有益效果，具有替代抗生素的潜力。

4 结 论

在肉仔鸡日粮中添加罗伊氏乳杆菌DBN-JP 制剂具有抑制病原菌生长、调节盲肠内容物菌群的有益效果。