TP53 与Wnt-5a 在甲状腺癌中表达分析及临床分期的指导意义

赵长海，张辰铭，孙春阳，郭文博，王 强，焦成斌

（1.佳木斯市中心医院普外科，黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯大学附属第一医院普外科，黑龙江 佳木斯 154002）

甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是一种内分泌系统肿瘤，其发病率逐年增加，以女性较为多见，其中90%以上为分化型甲状腺癌[1，2]。近年来对甲状腺癌的研究表明多种基因表达异常与其恶性生物学特点密切相关，然而对于甲状腺癌的具体发病分子机制尚未完全明确。人类P53 位于染色体17p13.1，目前已证实其在多种进展期、转移性肿瘤（脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等）中发生高频率突变或缺失是一种普遍现象[3]。突变型P53 具有抑制野生型P53 的功能，可使DNA的修复、促进细胞凋亡、细胞周期阻滞、调节代谢等肿瘤抑制功能丧失，同时还可促进肿瘤成形，这种突变体被称为TP53[4]。人类Wnt-5a 位于染色体3p14-21，是人体生长发育和病理修复过程中的一个关键因子，研究表明[5，6]，各种蛋白质能结合细胞膜表面不同的Wnt-5a 受体，在细胞内复杂的蛋白网络中参与细胞的分裂与凋亡。目前有关TP53、Wnt-5a 在甲状腺癌中表达模式及其与甲状腺癌临床病理分期关系的研究较少，基于此，本研究主要分析不同临床分期的甲状腺癌中TP53 和Wnt-5a 的表达特点，探讨其在甲状腺癌中表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2004 年7 月～2013 年9 月佳木斯市中心医院经过病理证实的50 例甲状腺癌组织、10 例癌旁正常腺体组织的石蜡标本及23 例甲状腺癌组织、10 例癌旁正常腺体组织的新鲜标本。石蜡标本中男性15 例，女性35 例，年龄20～77 岁，中位年龄41 岁；手术新鲜组织标本中男性13 例，女性20 例，年龄27～67 岁，中位年龄52 岁；依据美国肿瘤联合协会（AJCC）进行临床分期[7，8]：石蜡标本中甲状腺癌Ⅰ～Ⅱ期14 例、Ⅲ～Ⅳ期36 例。新鲜组织标本中甲状腺癌Ⅰ～Ⅱ期7 例、Ⅲ～Ⅳ期16 例。

1.2 主要试剂及器材 TP53 突变兔抗人多克隆抗体从上海兰顿生物技术股份有限公司购买，兔抗人的Wnt-5a 多克隆抗体购自上海兰顿生物科技有限公司，二氨基联苯胺（DAB）试剂盒购自北京翰谱医药生物研究所。β-actin、辣根过氧化物酶标记IgG 抗体、BCA、SDS-PAGE kit、考马斯亮蓝染色液、DNA和蛋白电泳标记Marker，ECL 超敏反应发光液、纯硝酸纤维素膜、丽春红染色被购自北京博奥生物有限公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（北京中杉金桥生物技术有限公司）、PCR 仪（美国应用生物系统公司型号：9800）、分析软件和凝胶图像分析系统BTNTA2020D（北京赛智创业科技有限公司）。PBS 1 L、0.01 mol/L 柠檬酸盐液、0.5 mol/L EDTA 缓冲液（pH 8.0）、1 mol/L 的TBS 缓冲液（pH 8.0）、酶消化液、封片剂。通过NCBI 中GeneBank 搜索框查询到P53 的order cDNA 框中显示P53 引物5-TCTGTCACTTGCACGTACTC-3，下游引物：5 端-CACGGATGTGAAGGGTGAAA-3 端。Wnt-5a 引物序 列：5-GACCTGGTCTACAT-CGACCCC-3 端，5端-GCAGCACCAGTGGAACTTGCA-3 端，引物合成由上海生物工程公司合成，扩增产物长度分别为348 bp、214 bp。β-actin 上游引物：5 端-ACCACCATGTACACAGGCAT-3 端，下游引 物：5 端-CTCTCTTTGCACTCACTAGGGG-3 端，扩增产物长度为150 bp。

1.3 免疫组织化学 SP 法：①脱蜡、水化；②PBS 洗2～3 次，各5 min；③3%二氧化氢滴加在切片上，室温下放置10 min 左右；④PBS 洗2～3 次，各5 min；⑤微波炉中抗原修复；⑥PBS 洗2～3 次，各5 min；⑦在每张病理切片中滴加适量的山羊血清封闭液，室温放置19 min，甩去多余液体；⑧滴加相应需要检测的TP53或Wnt-5aⅠ抗50 μl，室温环境下静置1 h，4 ℃过夜或者37 ℃1 h；⑨4 ℃过夜后在37 ℃复温45 min；⑩PBS 洗3 次，各5 min；每张切片中加入39～45 μlⅡ抗液，37 ℃条件下放置1 h；PBS 洗3 次，各5 min；DAB 液分别滴加D、A、B，5～10 min 后在显微镜下根据情况调整染色程度；PBS 或自来水冲洗10 min；染色结束后苏木精复染3 min，后用盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15 min；脱水、透明、封片、镜检。免疫组化染色结果判定：TP53 定位主要位于细胞核以染色结果目的蛋白出现黄或棕色颗粒为阳性，阴性为阳性细胞＜25%，阳性为阳性细胞＞25%，随机选择5 个高倍视野，计数1000 个细胞。

1.4 反转录PCR 总RNA 提取：①取200 mg 组织，放到1.5 ml EP 管中，在低温条件下加入1 ml Trizol剪碎；②对EP 管中的组织震荡30 s；③加入0.3 ml体积的氯仿，均匀充分摇动30 s 左右，室温下放置3 min；④8000×g，4 ℃离心，15 min；⑤吸掉上层无色水相，然后移入另一无菌EP 管中（约0.6 ml）；⑥加等体积异丙醇，-20 ℃，30 min；⑦8000×g，4 ℃离心，10 min，在EP 管底部可见微量RNA 的沉淀；⑧去掉EP 管中上清液，加75%乙醇1 ml 后振荡；⑨7500×g，4 ℃离心，10 min；⑩弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5～10 min；沉淀溶于20 μl DEPC 水，取1 μl 加入79 μl DEPC 水测OD260/OD280；计算浓度与纯度，-70 ℃保存。逆转录合成cDNA 反应体系：氯化镁、buffer、RNase-free dH2O、dntp、混合液、RNase 抑制剂、amv RNA transrciptase、random9 mers、positive control RNA 总体积10 μl，离心后反应条件：30 ℃、41 ℃、95 ℃、5 ℃。PCR 反应：加入PCR 目的基因引物、模版cDNA、RNA tap 聚合酶、PCR buffer、灭菌蒸馏水，总反应体积13 μl，混匀快速离心1 次，反应条件：95 ℃、94 ℃、95 ℃、57 ℃、71 ℃、72℃，共35 个循环。PCR 产物-20 ℃冰箱保存取PCR 产物8 μl 加5×Loading Buffer 2 μl 2%，通过110 V，95 mA 的电泳后，采用相应的染色剂（溴化乙锭）对跑完后电泳的凝胶进行着色，凝胶成象仪成象之后在电脑桌面上点击并保存，通过密度分析软件对测出各泳带的吸光度值，以目的基因和βactin mRNA 吸光度比值进行mRNA 半定量分析。

1.5 统计学方法 数据资料进行整理后录入Excel 表格，采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，比较采用t检验；计数资料以[n（%）]表示，比较采用χ2检验。采用Pearson 相关性分析甲状腺癌中TP53 与Wnt-5a mRNA 的关系。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TP53 蛋白、Wnt-5a 蛋白在甲状腺癌与癌旁组织中的表达 甲状腺癌TP53 阳性表达率为58.00%（29/50），高于癌旁组织的20.00%（2/10），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期TP53 阳性表达率分别为35.71%（5/14）、66.67%（24/36），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。甲状腺癌Wnt-5a 阳性表达率为40.00%（20/50），低于癌旁组的70.00%（7/10），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a 阳性表达率分别为64.29%（9/14）、30.56%（11/36），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 TP53 在甲状腺癌及癌旁组织中的表达

图2 Wnt-5a 在甲状腺癌及癌旁组织中的表达

2.2 TP53 mRNA、Wnt-5a mRNA 在甲状腺癌与癌旁组织中的表达分析 甲状腺癌TP53 mRNA 表达量为（0.54±0.040），高于癌旁组的（0.32±0.030），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌组Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期TP53 mRNA 表达量分别为（0.48±0.022）、（0.58±0.032），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。甲状腺癌Wnt-5a mRNA 表达量为（0.51±0.079），低于癌旁组的（0.79±0.028），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表达量分别为（0.71±0.036）、（0.50±0.053），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 甲状腺癌中TP53 与Wnt-5a mRNA 的关系Pearson 相关性分析显示，甲状腺癌中TP53 与Wnt-5a mRNA 呈负相关（r=-0.720，P＜0.05）。

3 讨论

P53 是一个癌症抑制蛋白质，在肿瘤调控过程中以及人体代谢、发育过程中具有重要作用。目前TP53 在国内的研究主要集中在卵巢癌，肺腺癌、肝癌、乳腺癌/三阴乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤中的蛋白表达特性，研究认为[9-12]，P53 和VEGF、P16、PAX2、PTEN、VHL、细胞增殖相关抗原、细胞周期素、缺氧诱导因子-1α、细胞增殖相关蛋白、Mir-34 家族在肿瘤中协同表达，导致了肿瘤细胞复杂的生物学特性，但是却较少从信号转导的角度研究P53 与信号转导途径的关系。有研究报道[13]，TP53 对ID4 基因表达具有促进作用。人类Wnt-5a转录并翻译生成的成熟蛋白是人体生长发育和病理修复过程中的一个关键因子，并参与细胞变化调控，若Wnt-5a 异常变化则会导致细胞增殖特性改变，进而出现增殖失控或增殖抑制。

本研究通过免疫组织化学技术和RT-PCR 在蛋白和mRNA 层面检测甲状腺癌中的TP53 的表达，结果显示甲状腺癌TP53 阳性表达率为58.00%（29/50），高于癌旁组织的20.00%（2/10），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期TP53 阳性表达率分别为35.71%（5/14）、66.67%（24/36），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高表达TP53 蛋白参与或者在肿瘤的发生中具有重要作用。此外，甲状腺癌TP53 mRNA 表达量为（0.54±0.040），高于癌旁组的（0.32±0.030），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌组Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期TP53 mRNA 表达量分别为（0.48±0.022）、（0.58±0.032），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），这种mRNA 表达的差异性与蛋白表达差异和模式相同，提示甲状腺癌TP53 的异常增高在转录和翻译两个层面参与了肿瘤的进展。

肿瘤的发生是一个多步骤多因素的过程，本研究通过免疫组织化学技术和RT-PCR 检测在甲状腺癌中的Wnt-5a 的差异表达，结果显示甲状腺癌Wnt-5a 阳性表达率为40.00%（20/50），低于癌旁组的70.00%（7/10），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a 阳性表达率分别为64.29%（9/14）、30.56%（11/36），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明Wnt-5a 在甲状腺癌组的阳性表达率低于癌旁组阳性表达率以及随甲状腺癌的高分期，其总体阳性率较低。此外，甲状腺癌Wnt-5a mRNA 表达量为（0.51±0.079），低于癌旁组的（0.79±0.028），差异有统计学意义（P＜0.05），其中甲状腺癌Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表达量分别为（0.71±0.036）、（0.50±0.053），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且相关性分析显示，甲状腺癌中TP53 与Wnt-5a mRNA 呈负相关（r=-0.720，P＜0.05）。由于肿瘤分期越高往往提示肿瘤恶性程度以及侵袭性越高，这些结果显示Wnt-5a 在甲状腺癌的发生过程中可能有抑制癌细胞生长和转移、促进细胞分化的作用。

综上所述，TP53 和Wnt-5a 基因的表达参与了甲状腺癌的发生发展，同时Wnt-5a 激活的信号转导途径可能在临床甲状腺癌的治疗中具有辅助作用，二者联合检测对临床手术方式、术后治疗策略选择、预后评估具有重要的价值。