广西黑衣壮儿童VDR基因rs1544410、rs7975232位点多态性研究

陆壮念，林娜，梁立婷，杨丽娟

(1. 右江民族医学院附属医院儿科，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000)

维生素D受体(Vitamin D receptors，VDR)基因定位于人染色体12q13上，能够编码亲核蛋白，从而介导1，25(OH)2D3在人体生理学过程中发挥生物效应[1]。研究发现[2]，VDR基因突变与遗传学疾病的发生有关。VDR基因中单个碱基突变虽然不明确引起遗传病，但在人群中有一定分布频率成为单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)[3]。这种SNP多态性可稳定遗传，从而引起子代多种疾病发生发展。目前国内外研究报道共有22个点突变能够导致VDR基因功能的缺失[4-5]。rs1544410、rs7975232位点的基因型和等位基因频率在不同地区、不同种族之间差异报道结论不一，而在广西黑衣壮儿童中分布研究尚未见报道。本次研究通过选取115例广西黑衣壮儿童为研究对象，分析其VDR基因rs1544410、rs7975232位点基因型和等位基因分布及特点，比较与其他地区不同种族人群差异情况，为后续研究VDR在不同地区种族人群中与各种疾病相关性和致病因素研究提供科学理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年5月—2019年5月在我院儿童保健康复科体检健康儿童为研究对象。纳入标准：①年龄<14岁；②临床指标、发育指标正常；③儿童祖辈三代均为广西黑衣壮；④儿童本人和(或)监护人知情同意并自愿参与研究。最后纳入115名，男童66名，女童49名，年龄3～12岁。本次研究经过我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采取所有研究对象外周静脉血2 ml，置于EDTA抗凝管中，3500 r/min，15 min离心取上层血清。采用离心柱型血液基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，操作步骤详见说明书，置入-80℃保存待测。

1.2.2 引物设计 通过primer3在线软件(http：//primer3.ut.ee/)设计引物，委托捷瑞生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增rs1544410 位点和rs7975232位点的引物见表1。

表1 rs1544410位点和rs7975232位点引物序列

1.2.3 PCR扩增反应 采用15 μl反应体系，其中包括2.0 μl模板 DNA，10×Buffer1.5 μl 、Mg2+1.5 μl 、1 UTaq 酶、0.3 μl dNTP、1 μl多重PCR引物，剩余的体积用双蒸水补足至15 μl ，充分混匀，离心，置入八连管中。PCR反应采用东胜龙黑金刚 EDC-810 PCR 仪，反应条件：95℃预变性 2 min；扩增程序：95℃ ×3 min，94℃×15 s，55℃×15 s，72℃ ×30 s，共35个循环，最后72℃延伸 3 min。

1.2.4 PCR产物纯化 PCR扩增后取3 μl产物用0.2 μl ExoI(Fermentas公司)和0.8 μl Fer-mentas公司生产的FastAP纯化。

1.2.5 延伸反应 延伸反应体系：PCR 产物2 μl ，SNaPshot Multiplex kit 1 μl ，延伸引物1 μl ，水补至6 μl 。延伸反应程序：96℃ ×1 min；96℃ ×10 s，52℃×5 s，共30个循环60℃×30 s。

1.2.6 SNP分析 取1 μl加入10 μl buffer，95℃变性 3 min，立即冰水浴，上测序仪(ABI3730xl)。SNP分型用 GeneMapper 4.1软件分析。

1.3 其他民族、地区基因多态性数据获取 通过在线Ensembl基因组数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)获取千人基因组计划VDR基因位点rs1544410、rs7975232在其他民族、地区基因多态性分布数据。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据的统计分析，用计数法直接计算基因型和等位基因频率，采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验群体代表性，基因型频率和等位基因频率采用χ2检验或Fisher确切概率法作比较，检验水准：α =0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNP位点Hardy-Weinberg平衡和基因型分布 VDR基因位点rs1544410、rs7975232基因分型经Hardy-Weinberg平衡检验分析，两位点基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，所选人群均具有群体代表性(P>0.05)，结果具有代表性。rs1544410位点存在CC 、CT两种基因型，基因型峰型见图1。rs7975232位点存在CC 、AA 、AC三种基因型，基因型峰型见图2。

注：A为CC基因型峰型；B为CT基因型峰型。

注：A为AA基因型峰型；B为AC基因型峰型；C为CC基因型峰型。

2.2 VDR基因rs1544410、rs7975232 SNP分布 广西黑衣壮儿童人群VDR 基因rs1544410基因型CC和CT、等位基因C和T在男童和女童中分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。rs7975232基因型CC、AC、AA和等位基因A、C在男童和女童中分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 VDR基因rs1544410位点多态性在广西黑衣壮儿童中的比较

表3 VDR基因rs7975232位点多态性在广西黑衣壮儿童中的比较

2.3 VDR基因rs1544410、rs7975232不同地区、民族间比较 经过比较分析，广西黑衣壮儿童rs1544410基因型分布、等位基因频率与1000 Genomes Project的JPT、YRI、GIH、IBS差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。广西黑衣壮儿童rs7975232与1000 Genomes Project的YRI、GIH、IBS差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

3 讨论

VDR是类固醇急速受体和甲状腺激素受体超家族和能源之一，本质上是一种配体依赖性转录因子[6]。维生素D的绝大多数生物学功能是通过VDR介导从而调节靶基因转录过程而实现。随着分子生物学技术

表4 VDR基因rs1544410位点基因型和等位基因分布频率与各种族人群中的比较

表5 VDR基因rs7975232位点基因型和等位基因分布频率与各种族人群中的比较

和基因组学的发展，学者发现VDR上存在多个SNP位点，这些位点与疾病的发生、发展有关。而遗传可能与环境因素相互作用，从而导致疾病在不同人群中发生率有差异。VDR基因位于人类常染色体12q13上，由8个编码外显子和6个非编码外显子交替剪接而成，约75个碱基[5]。VDR广泛分布于人体内组织细胞中，除了分布在肠道、肾脏和骨骼等靶器官外，在血液系统、泌尿生殖系统、神经系统和多种免疫细胞膜中也有分布[7]。

目前研究发现，VDR的SNP与慢性肾脏病[8]、糖尿病[9]、支气管哮喘[10]、自身免疫性疾病[11]、结核病[12]、肿瘤[13]和高血压[14]等多种疾病有关。Zhao DD 等[15]通过荟萃分析发现，亚洲儿童哮喘中ApaI基因(rs7975232)SNP起到特殊作用，但BsmI(rs1544410)基因SNP对儿童哮喘易感性的影响却很小。Li J等[16]研究发现，VDR基因的7579232位点可能与中国汉族人群的系统性硬化症患者的发病有关，且ApaI基因型频率的优势模型可能与红细胞沉降率风险增加有关。Al-Ghafari AB等[17]在沙特人中研究发现，VDR SNPs rs7975232的SNP增加直肠癌的发生风险，而rs1544410 SNP降低了直肠癌的发生风险，提示ApaI和TaqI SNP可能被用作沙特人直肠癌的诊断生物标志物。Pepineli AC等[18]研究发现，VDR的SNP与麻风病的发生有关，但rs1544410、rs975232位点SNP形成的单倍型与麻风病本身和多细菌临床形式有关。以上研究均证明，同一基因位点在不同地区人群中可能导致不同疾病的发生风险不同。因此为了了解不同地区、不同民族或种族VDR基因多态性的分布和表达差异，为SNP在疾病的基因诊断、个体化治疗实施中应用提供科学理论依据。

壮族是我国人数最多的少数民族，集中分布在广西壮族自治区。黑衣壮是壮族中一个重要的支系，聚居于西南边陲广西那坡县境内[19]。本次研究中发现，广西黑衣壮儿童中VDR基因rs1544410中CC、CT基因型占比分别为87.83%、12.17%，等位基因C为93.91%。rs7975232中基因型CC、AC基因型占比为48.70%、43.48%，等位基因C为70.43%。两个SNP位点基因型和等位基因频率在不同性别儿童中分布差异无统计学意义，提示性别对VDR基因SNP分别影响不明显，在分析VDR两个SNP位点与其他疾病相关性时可以不考虑性别对基因分布的影响。此外，我们还与千人基因组计划(1000 Genomes Project)研究的结果进行比较。千人基因组计划是由中美英等多国科研机构联合发起的，包括欧洲、美洲、亚洲、非洲的14个国家和地区不同人群中2500人的基因数据，是科学界首次千人规模以上基因组的比较，通过发现一些罕见的基因变异，分析与疾病的相关性，为指导预防、治疗相关疾病提供参考。本次研究中与千人基因计划中JPT、YRI、GIH、IBS中VDR基因rs1544410和rs7975232基因型和等位基因频率，结果发现，广西黑衣壮儿童rs1544410、rs79752325与其他地区人群相比，基因分布和等位基因频率差异有统计学意义 ，提示在分析VDR两个SNP位点与其他疾病相关性时要考虑地区和民族或种族的差异。而这些差异的形成可能是基因和不同地区环境联合作用导致[20]，可能与生活环境、气候变化、饮食等因素有关[21]。

本次研究对广西黑衣壮儿童VDR基因在分析VDR两个SNP位点与其他疾病相关性时位点基因型和等位基因频率分布及特点进行首次报道，为VDR基因的SNP与广西儿童疾病相关性研究提供信息，同时也有助于研究地区性疾病的致病因素以及发生发展的深入研究。但本次研究也存在一定的不足之处。首先，研究的样本量小，样本来源单一，可能存在选择偏倚；第二，三代以内黑衣壮信息由研究对象提供，其真实性无法判断，可能影响结果的可靠性；第三，研究结果具有区域代表性，在外推应用上可行性局限。这些都有待我们后续扩大样本量、进一步深入研究解决。

综上所述，广西黑衣壮儿童VDR基因rs1544410，rs7975232位点SNP具有地域性，可为当地VDR基因相关疾病的预防和诊疗研究提供科学理论依据。