IRE1对重症急性胰腺炎大鼠淋巴细胞凋亡的作用研究

宋嗣恩，覃月秋，黄赞松，周喜汉

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院消化内科，广西 百色 533000)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是消化内科常见的急危重症，约占急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)20%，该病起病凶险、并发症多、治疗费用高、预后差、病死率高[1-2]。临床上SAP的早期表现为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，晚期常因继发感染导致多器官功能障碍(multiple organ dysfunction，MODS)。有研究发现淋巴细胞凋亡异常导致机体免疫失衡是SAP患者继发感染及脓毒症的重要原因[3]，但其分子机制尚不清楚。最近研究发现肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)参与了细胞凋亡的调节[4]，而IRE1是否参与SAP淋巴细胞凋亡的调节文献报道较少。为明确IRE1在大鼠SAP淋巴细胞凋亡中的作用，本研究应用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠诱导SD大鼠SAP动物模型，RT-qPCR检测脾脏淋巴细胞IRE1 mRNA、Caspase-3 mRNA的表达情况，流式细胞术检测淋巴细胞凋亡，初步探讨IRE1对SAP大鼠脾淋巴细胞凋亡的作用，为阐明SAP机体免疫失衡机制，寻找干预和治疗SAP新靶点，提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 20只体重控制在250～300 g的成年SD大鼠，牛磺胆酸钠(美国Sigma)；大鼠淀粉酶和脂肪酶测定试剂盒(北京冬歌博业生物科技有限公司) ；总RNA提取试剂盒(上海闪晶分子生物科技有限公司)；Fastking RT Kit(上海闪晶分子生物科技有限公司)； SYBR Green(上海闪晶分子生物科技有限公司)；PCR引物IRE1、 Caspase-3合成(上海捷倍思基因技术有限公司)；Anti- IRE1抗体、Anti-Caspase-3抗体(默克生命科学)；紫外分光光度计；罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 采用随机数字表法将20只大鼠随机分为假手术组(SO组)、SAP组，每组10只。SO组大鼠仅开腹翻动胰腺后关腹，SAP组大鼠在胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠0.1 ml/100 g构建SAP模型[5]。

1.2.2 胰腺组织病理学及评分 按照Schmidt评分细则及方法[6]，胰腺组织石蜡包埋，超薄切片机切成4微米/片，HE染色后，采用双盲法，转显微镜下由两名病理医生进行阅片评分，随机选取5个400×视野/片，进行观察以下4种病理状态：①水肿(edema)；②出血(hemorrhage)；③坏死(necrosis)；④炎症浸润(inflammatory infiltration)，这4种病理状态作为病理损伤严重程度评分的参考依据，逐一进行评分，并做好记录。

1.2.3 淀粉酶和脂肪酶检测方法 按照大鼠淀粉酶和脂肪酶检测试剂盒说明书进行检测。

1.2.4 脾脏淋巴细胞分离 研磨脾脏组织，制备脾脏组织单细胞悬液，加1×PBS或1640无血清培养液3 ml按照1∶1 比例稀释；混匀，37℃水浴中平衡，吸取脾脏组织单细胞悬液至淋巴细胞分离液液面上，置于20℃，2000 r/min水平离心机离心20 min，吸取乳白色淋巴细胞层，加入15 ml离心管中，然后加入细胞洗涤液10 ml，混匀细胞，离心10 min(转速1500 r/min)，倒掉上清液，重复操作本步骤一次。将重悬的细胞转移到平皿中， 5%CO2培养箱中设定温度37℃，进行培养60 min，待单核细胞贴壁后，收集所需的淋巴细胞悬液。

1.2.5 RT-qPCR检测 IRE1 mRNA、Caspase-3 mRNA表达内参β-actin引物序列：F5′-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3′，R5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′。IRE1序列：F5′-GGACTGCCTGGGTCTTTGAT-3′，R5′-TGTGGGGTCAAACGCCTATT-3′。Caspase-3序列：F5′-CTAGCTCCTAGTCTCTGCTCCC-3′，R5′-TCCGTCCCCAATACGTGTCGAATGCA-3′。按照操作说明书，分别提取各组脾脏组织的总RNA，采用紫外分光光度计检测OD260、OD280其浓度。抽取2 μg总RNA采用逆转录法合成cDNA，将其存入-80℃冰箱。采用SYBR Green扩增cDNA，并使用PCR仪检测。以β-actin分析IRE1和Caspase-3的mRNA表达水平。每组设3个复孔进行对照，利用2-△△CT法计算IRE1及 Caspase-3的mRNA相对表达量。

1.2.6 流式细胞术检测淋巴细胞凋亡 分离好的淋巴细胞悬液，采用低温PBS重复洗涤细胞，细胞用1×Binding Buffer调为1×106/ml，吸取100 μl淋巴细胞悬液转移至5 ml流式管中，各加入5 μl PI 和5 μl AnnexinV-FITC，缓慢混匀细胞悬液，孵育(条件为：室温25℃，避光15 min)，将400 μl 1×Binding Buffer加入每个流式管，上机检测。

2 结果

2.1 大鼠胰腺病理评分 SO组胰腺腺泡结构清晰，无明显水肿，偶有炎性细胞浸润；SAP组胰腺腺泡高度水肿，出现腺泡结构的破坏，可见间质内的红细胞渗出和出血、坏死，血管损伤或血栓形成， 间质水肿，间隔模糊变宽，炎症反应明显，可见脂肪坏死，导管扩张，腺泡细胞萎缩。按照Schmidt评分细则，SAP组与SO组比较，胰腺病理组织学评分显著性增加，见表1。

表1 大鼠胰腺病理组织损伤评分

2.2 大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平 SAP组中大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平含量均显著升高，与SO组相比，差异有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平含量 单位：U/L

2.3 大鼠脾脏淋巴细胞IRE1、Caspase-3 mRNA相对表达量 SO组大鼠脾脏淋巴细胞中IRE1 、Caspase-3 mRNA相对表达量呈低表达，SAP组大鼠中IRE1 mRNA相对表达量显著升高，与SO组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注：与SO组相比较，*：P<0.05。

2.4 流式细胞术检测大鼠脾淋巴细胞凋亡情况 使用二维散点图表示大鼠脾淋巴细胞凋亡率，以Annexin-V FITC为横坐标，PI为纵坐标，以阴性对照、PI单染管和FITC单染管设定界限，把淋巴细胞分成：正常活细胞(左下象限Q4，Annexin-V FITC-、PI-)；早期凋亡细胞(右下象限Q3，Annexin-V FITC+、PI-)；死亡细胞(右上象限Q2，Annexin-V FITC+、PI+)。SAP组脾淋巴细胞凋亡率与SO组比较，脾淋巴细胞凋亡率升高(P<0.001)，见表3、图2。

表3 实验大鼠脾血淋巴细胞凋亡率

2.5 SAP大鼠脾淋巴细胞中IRE1与Caspase-3 mRNA相对表达量相关分析 SAP组中脾脏淋巴细胞IRE1 mRNA与脾脏淋巴细胞Caspase-3 mRNA相对表达量呈正相关(r=0.884，P<0.05)，提示脾脏淋巴细胞IRE1 mRNA表达增高，脾脏淋巴细胞Caspase-3 mRNA水平随之上升，见图3。

2.6 SAP大鼠脾淋巴细胞中IRE1 mRNA表达与凋亡率的相关分析 SAP组中脾脏淋巴细胞IRE1 mRNA与脾脏淋巴细胞凋亡率呈正相关(r=0.875，P<0.05)，显示脾淋巴细胞中IRE1表达的增高，脾脏淋巴细胞凋亡率升高，见图4。

3 讨论

SAP是由胰腺的局部炎症引发严重的全身多器官损害的疾病，它主要以致命的MODS和SIRS为特征[7]。尽管临床上大部分的SAP患者能够得到及时诊断和必要的治疗，但治疗手段和方法的选择仍然十分有限[8]。目前，SAP仍然是一个高发病率和死亡率的消化系统疾病，据统计仅在欧洲SAP患者死亡率甚至高达44%[9]。AP首先从无菌的局部炎症开始，诱发SIRS，然后是代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)，有相关研究表明在SAP小鼠中SIRS和CARS可并行发展[10]，最终导致机体免疫抑制。SAP初期始于胰腺组织的局部炎症，可导致多种胰腺外器官功能障碍的发生，然而，潜在的机制仍不清楚[11]。研究表明淋巴细胞大量凋亡导致SAP患者淋巴细胞亚群减少，是影响机体产生免疫抑制的重要因素[5，12]。我们采用流式细胞术检测SAP大鼠脾淋巴细胞凋亡率，结果发现SAP淋巴细胞凋亡率增高，与前人的研究结果一致[13-14]，提示机体免疫功能受损。

SO组

SAP组

图3 SAP大鼠脾淋巴细胞中IRE1与Caspase-3mRNA表达水平的相关性

图4 SAP大鼠脾淋巴细胞中IRE1与凋亡率的相关性

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是新近研究发现的调控细胞凋亡的信号转导通路[15]。细胞应激是AP等胰腺疾病发生的先决条件，当细胞受到刺激时，内质网发生紊乱，且堆积着大量的错误/未折叠蛋白质，引发未折叠蛋白反应(UPR)以保持内质网稳态。但持续性内质网应激可诱发炎症，严重时可致细胞凋亡，且与AP的细胞凋亡存在显著关系[16]。越来越多的证据表明ERS是损伤胰腺腺泡细胞的早期反应，是AP的发病机制之一[15]。

IRE1内质网应激信号途径，是启动的触发UPR的最保守的途径[17]。有文献报道AP通过IRE1通路激活胰腺的ERS，IRE1、 XBP1 mRNA和蛋白水平显著升高[4]，而ERS可能通过胰腺腺泡细胞凋亡导致实质损伤[18]。IRE1α内切酶是ERS的关键调控因子，控制着肿瘤细胞的存活和凋亡。抑制IRE1α内切酶可导致剪接XBP1的减少，从而降低癌细胞的增殖，增加细胞的死亡[19]。通过抑制自适应的UPR反应信号通路，IRE1还激活内质网应激通路，促进细胞死亡和胰腺炎[20]。我们研究发现SAP大鼠脾淋巴细胞IRE1表达明显升高，提示SAP时内质网IRE1途径激活，IRE1可能参与SAP的发病，这与Jia G等[21]在其他动物身上的研究结论相符，但是否与淋巴细胞凋亡相关尚不明确，因此我们进一步检测了脾淋巴细胞Caspase-3表达，并进行了相关研究。

为明确IRE1与SAP淋巴细胞凋亡的关系，我们做了IRE1与Caspase-3表达及淋巴细胞凋亡率相关性分析，结果显示SAP组中脾脏淋巴细胞中IRE1 mRNA表达增高，同时脾脏淋巴细胞Caspase-3 mRNA水平及淋巴细胞凋亡率亦升高。进一步分析发现，脾脏淋巴细胞IRE1 mRNA表达水平与Caspase-3 mRNA表达水平呈正相关，IRE1 mRNA与淋巴细胞凋亡率呈正相关。综合以上分析， IRE1高表达，有可能是在SAP中导致淋巴细胞凋亡增加的重要原因。淋巴细胞是一种重要的炎性细胞，其表达水平通常代表着炎症水平的高低。在SO组中，淋巴细胞的比例低，凋亡水平低，正说明了SO组中淋巴细胞处于一个良性的循环中。相反，淋巴细胞在SAP组中的高表达与高凋亡，说明了淋巴细胞的生成与因抗炎所致的凋亡，处于一个高速的循环之中。由于淋巴细胞能分泌诸多炎性因子，炎性因子在SAP患者体内的蓄积，可导致“炎症风暴”的产生，这是胰腺炎患者死亡最常见的原因之一[22-23]。因此通过调控IRE1的表达，干预淋巴细胞的凋亡，减少炎症因子的释放可能是SAP的一个新的治疗思路。