不同钾肥对渍水胁迫下紫花苜蓿叶绿素荧光特性的影响

宋述锐，于 华，黄 椰，张卫红

（1. 中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室 中国科学院武汉植物园，湖北 武汉 430074；2. 中国科学院大学， 北京 100049）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上最重要的多年生优质豆科牧草之一，其生长迅速，适应性强，产量高，抗逆性强，素有“牧草之王”之美称，具有较高的经济价值、应用价值和生态价值[1-2]。紫花苜蓿栽培历史悠久，其主要在我国华北、西北、东北等地区广泛种植。近年来，随着农业生产结构调整的深入和南方畜牧业的快速发展，紫花苜蓿在南方地区的种植范围逐渐扩大，但是南方地区降水量较多，多雨的气候条件容易造成土壤的渍水[3-4]。值得注意的是，紫花苜蓿对渍水胁迫极其敏感，渍水胁迫往往使紫花苜蓿根系腐烂，病菌滋生，从而造成生产力严重下降[5]。因此，如何有效提高紫花苜蓿的耐渍水能力是南方地区紫花苜蓿种植过程中亟需解决的重要问题。

渍水胁迫下，紫花苜蓿叶片气孔关闭，气孔导度降低，CO2扩散受阻，蒸腾速率降低；长期渍水胁迫下，叶片叶绿素含量降低，光合系统遭到破坏，PSⅡ受到抑制，电子传递受阻，进而导致光合速率降低，紫花苜蓿的生长发育因此受到不同程度的抑制[6-8]。此外，渍水胁迫会降低紫花苜蓿的钾元素含量[9]。而钾元素在提高植物的抗逆过程中具有重要的作用。钾元素可以提高植物叶绿素a (Chl a)和叶绿素b (Chl b)的含量，促进植物叶绿素的合成和稳定；调节气孔的开放和关闭，控制CO2和水的进出，维持正常膨压和水分平衡；提高植物PSⅡ的活性，促进电子传递及光合磷酸化，调节Rubisco 的活性，增强CO2的固定能力，并提高净光合速率，从而促进植物的抗逆性[10-12]。鉴于此，本研究以紫花苜蓿作为试验材料，分析了施用不同钾肥对渍水胁迫下紫花苜蓿的生长、叶绿素含量、叶绿素荧光特性和营养品质的影响，并比较了硝酸钾(KNO3) 和氯化钾(KCl) 对渍水胁迫下紫花苜蓿耐渍水能力的影响，以期为合理利用钾肥提高紫花苜蓿的耐渍水能力和紫花苜蓿耐涝性研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与培养

试验采用盆栽法，即在直径25 cm、高30 cm 的花盆内装入相同质量的土壤。挑选饱满的紫花苜蓿种子，用0.1% HgCl2消毒5 min 后，蒸馏水冲洗3～4 次后，进行播种，播深1 cm，然后将其置于温室中培养，培养条件：恒温28 ℃、14 h /10 h(昼/夜)，光照强度850 μmol·(m2·s)-1，相对湿度60%～70%。待出苗后，每盆保留长势一致的幼苗20 株，将其继续置于该温室中进行培养，当培养至1 月龄时对其进行渍水处理。

1.2 试验设计与处理

将花盆置入55 cm × 40 cm × 40 cm (长×宽×高)的塑料盆中，以水面淹过土壤表面2 cm 作为渍水胁迫标准。试验设置4 个处理，对照处理组(不进行渍水胁迫和施用钾肥，记作CK)、渍水处理组(单一渍水胁迫，记作W)、渍水 + 5 mmol·L-1KCl 处理组(添加与单一渍水处理组相同体积的5 mmol·L-1KCl 水溶液，记作W + KCl)和渍水 + 5 mmol·L-1KNO3处理组(添加与单一渍水处理组相同体积的5 mmol·L-1KNO3水溶液，记作W + KNO3)，每个处理均为5 次重复：渍水处理时每3 d 分别补充1 次蒸发掉的水溶液，使水面一直处于淹过土壤表面2 cm 的状态，处理15 d 后进行取样，并分别测定各项指标。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 生长特性与生物量的测定

水渍处理15 d 后，每盆随机选取10 株紫花苜蓿，将幼苗从花盆中取出，将根用自来水冲洗干净后，再用蒸馏水冲洗3～4 次，用滤纸吸干表面的水分，使用直尺(精度0.1 cm)测量其株高和根长的绝对长度。将根、茎、叶分离后置于105 ℃杀青30 min后，65 ℃烘干至恒重，分别测其质量。

1.3.2 叶绿素含量的测定

称取紫花苜蓿新鲜叶片0.1 g，剪碎，放入10 mL离心管中，加入5 mL 95%酒精，在黑暗条件下振荡浸提直至组织变白，静置3～5 min，用分光光度计测665 和659 nm 下的吸光度，计算叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b)和总叶绿素含量(Chl tot)。

Chl a (mg·g-1) = (13.95×OD665- 6.88×OD649) ×0.005 ÷ m；

Chl b (mg·g-1) = (24.96×OD649- 7.32 × OD665) ×0.005 ÷ m；

Chl tot (mg·g-1) = (18.08 × OD649+ 6.63 × OD665) ×0.005 ÷ m。

式中：OD649和OD665分别为浸提液在649 和665 nm下的吸光度，m 为紫花苜蓿叶片质量。

1.3.3 叶绿素a 荧光瞬态曲线的测定

采 用PAM 2500 (Heinz Walz，Germany) 测 定 紫花苜蓿叶片叶绿素a 荧光参数。测定时首先将紫花苜蓿暗适应25 min，然后使用叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光OJIP 瞬态曲线，每个处理测9 次重复。为了保证所有光系统Ⅱ反应中心的闭合以获得真正的最大荧光激发强度，暗适应25 min 后，OJIP 瞬变由3 000 μmol·(m2·s)-1的红光(λ = 650 nm)激发，测量强光脉冲引起的叶绿素荧光，在10 μs 和320 ms之间进行数字化，使用JIP 测试方法和计算公式计算分析OJIP 瞬时曲线。

1.3.4 慢速荧光参数的测定

采 用PAM 2500 (Heinz Walz，Germany) 测 定 紫花苜蓿叶片慢速荧光。经过30 min 的黑暗适应后，在远红外光[FR，730 nm，10 μmol·(m2·s)-1]激发下测定暗适应状态下的最小荧光值(Fo)。然后，施加0.8 s饱和脉冲[3 000 μmol·(m2·s)-1]测定暗适应状态下的最大荧光(Fm)。随后，给予白光[160 μmol·(m2·s)-1]以诱导光化学反应并使其达到稳定。诱导期间，每施以一次饱和脉冲[3 000 μmol·(m2·s)-1]，以记录光适应状态下的最大荧光产量(F'm)，用于淬灭分析。在诱导结束时，关闭光照，立即在远红光激发下记录光适应状态(F'o)的最小荧光。

1.4 统计分析

所有数据均通过Excel 2010 进行汇总，采用SPSS 19.0 对其进行统计分析，利用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 检验对不同处理组紫花苜蓿的株高、生物量、叶绿素含量和叶绿素荧光参数进行方差分析和多重比较，结果以平均值 ±标准误表示。采用Origin 软件作图，不同小写字母表示显著性差异(P ＜ 0.05)。

2 结果与分析

2.1 钾肥对渍水胁迫下对紫花苜蓿生长特性的影响

施用钾肥能够有效提高紫花苜蓿的耐渍水能力。如图1A 所示，渍水胁迫下，紫花苜蓿茎秆变红、变细。根系发黑腐烂，叶片脱落。然而，渍水胁迫下施用KCl 和KNO3均能够有效减缓了紫花苜蓿叶片的脱落和根系的发黑程度，其中KNO3对渍水胁迫下紫花苜蓿的缓解作用优于KCl。此外，渍水胁迫显著抑制了紫花苜蓿的根长，较对照降低了29.24%(P ＜ 0.05)；而渍水胁迫下施用KCl 和KNO3能够有效缓解渍水胁迫对紫花苜蓿株高和根长的抑制作用，其株高较渍水处理分别提高了8.99% (P ＞ 0.05)和14.65% (P ＜ 0.05)，根长也分别显著 (P ＜ 0.05)提高了34.16%和43.61% (图1B 和图1C)。

2.2 钾肥对渍水胁迫下紫花苜蓿生物量的影响

渍水胁迫在限制紫花苜蓿植株和根系伸长生长的同时也抑制了其生物量的积累。渍水胁迫下，紫花苜蓿的根干重和茎叶干重较对照显著降低了52.0%和27.84% (P ＜ 0.05) (图2)。施用KCl 和KNO3能够缓解渍水胁迫对紫花苜蓿生物量积累的抑制。其中，渍水胁迫下施用KCl 时，紫花苜蓿的根干重和茎叶干重较渍水胁迫显著增加了80.64%和15.18%(P ＜ 0.05) (图2)。渍水胁迫下施用KNO3时，其根干重和茎叶干重较渍水胁迫显著增加了97.99%和35.45% (P ＜ 0.05) (图2)。由此可见，KNO3对渍水胁迫下紫花苜蓿生物量积累的促进作用优于KCl 。

2.3 钾肥对渍水胁迫下紫花苜蓿叶绿素含量的影响

如图3 所示，渍水胁迫下，紫花苜蓿叶绿素含量显著降低(P ＜ 0.05)，叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b)和叶绿素总含量(Chl tot)分别较对照降低了9.45%、60.30%和36.83%，渍水胁迫显著提高了紫花苜蓿的Chl a/Chl b。由此可见，渍水胁迫对紫花苜蓿叶绿素b 的抑制作用大于对叶绿素a 的抑制作用。KCl和KNO3能够明显缓解水渍胁迫对紫花苜蓿叶绿素含量的影响，其中KNO3对渍水胁迫下紫花苜蓿叶绿素b 含量和总叶绿素的含量的促进作用明显优于KCl。然而，渍水胁迫下施用KCl 时紫花苜蓿的Chl a/Chl b 显著高于施用KNO3时紫花苜蓿的Chl a/Chl b (P ＜ 0.05)。

2.4 钾肥对渍水胁迫下紫花苜蓿OJIP 瞬态曲线的影响以及JIP 检验

图 1 不同钾肥(KCl 和KNO3)对渍水胁迫下紫花苜蓿生长的影响Figure 1 Effects of KCl and KNO3 on growth of alfalfa under waterlogging

植物叶绿素a 荧光与植物的光合作用密切相关，渍水胁迫下，紫花苜蓿的叶绿素a 荧光Fo(图4中O 点对应的荧光强度值) 高于对照，Fm(图4 中P 点对应的荧光强度值)则低于对照。与此相反，无论是KCl 还是KNO3都提高了渍水胁迫下紫花苜蓿的OJIP 荧光瞬态曲线(图4A)。为了增加不同处理之间的可比性，随后对OJIP 曲线按照O-P 标准分析(ΔVt) (图4B)，渍水胁迫下紫花苜蓿的OJIP 曲线J 点、I 点、P 点的相对荧光强度变化最为强烈，而施用KCl 和KNO3之后，相对荧光强度明显降低，说明施用钾之后明显降低了J 点、I 点、P 点的荧光散耗。将渍水胁迫时紫花苜蓿的OJIP 曲线进行O-K标准化、O-J 标准化以及O-I 标准化之后与CK 组标准化曲线做差而得到差别动力学曲线ΔWOK、ΔWOJ和ΔWOI，对比发现，施用钾肥可以恢复渍水胁迫所引起的ΔWOK、ΔWOJ和ΔWOI的升高。

为了进一步检验KCl 和KNO3对渍水胁迫下紫花苜蓿叶绿素荧光功能参数和性能指标的影响，对其进行JIP-test 分析。首先，从OJIP 荧光瞬态曲线上对其原始数据进行提取(表1)，渍水胁迫和施用钾肥对紫花苜蓿的初始荧光值(Fo) 均无显著性差异，但渍水胁迫使得紫花苜蓿的最大荧光值(Fm)显著低于对照，渍水胁迫下施用KCl 和KNO3显著增加了紫花苜蓿的最大荧光值(Fm)，较单一渍水处理分别增加了16.13%和20.43%。φEo、ψEo、RC/ABS 和ƴRC 是评价叶绿素a 荧光光合效率和量子产率的4 个重要指标。渍水胁迫下紫花苜蓿的φEo、ψEo、RC/ABS和ƴRC 显著(P ＜ 0.05)低于对照组，较对照分别降低了37.21%、32.08%、40.00% 和34.48%，而渍水胁迫下施用KCl 和KNO3能够显著(P ＜ 0.05)增加紫花苜蓿的φEo、ψEo、RC/ABS 和ƴRC。其中渍水胁迫下施用KCl 时，其φEo、ψEo、RC/ABS 和ƴRC值较单一渍水处理增加了40.74%、33.33%、41.67%和31.58 %。渍水胁迫下施用KNO3时，φEo、ψEo、RC/ABS 和ƴRC值较单一渍水处理分别增加了44.44%、36.11%、33.33%和26.32%。ABS/RC、TPo/RC 和REo/RC 是评价叶绿素a 荧光比能量通量的3 个重要指标，渍水胁迫显著增加了紫花苜蓿的ABS/RC、TRo/RC 和REo/RC，较对照分别增加了68.00%、55.22% 和21.62%，渍水胁迫下施用KCl 和KNO3能够显著降低紫花苜蓿的ABS/RC 和TPo/RC(P ＜ 0.05)，降低REo/RC (P ＞0.05)。

图 2 不同钾肥(KCl 和KNO3)对渍水胁迫下紫花苜蓿生物量的影响Figure 2 Effects of KCl and KNO3 on alfalfa biomass under waterlogging

图 3 不同钾肥(KCl 和KNO3)对渍水胁迫下紫花苜蓿叶绿素含量的影响Figure 3 Effects of KCl and KNO3 on chlorophyll content of alfalfa under waterlogging

PIABS和PItotal是叶绿素a 荧光的两个重要性能指标。渍水胁迫下紫花苜蓿的PIABS和PItotal显著低于对照处理，较对照降低了77.04%和73.21%。渍水胁迫下施用KCl 和KNO3与渍水胁迫相比显著(P ＜0.05)提高了紫花苜蓿的PIABS和PItotal，其中渍水胁迫下施用KCl 时PIABS和PItotal值较单独渍水处理提高了164.44%和116.67%；渍水胁迫下施用KNO3时，其PIABS和PItotal值较单独渍水处理提高了162.22%和96.67%。

图 4 不同钾肥(KCl 和KNO3)对渍水胁迫下紫花苜蓿OJIP 瞬态曲线的影响Figure 4 Effects of KCl and KNO3 on the OJIP transient curve of alfalfa under waterlogging

2.5 不同钾肥对渍水胁迫下紫花苜蓿慢速叶绿素荧光参数的影响

最大光合效率(Fv/Fm) 反映了植物对生长环境长期适应的机制，是反映光合效率最重要的因素之一。渍水胁迫显著降低了紫花苜蓿的Fv/Fm，然而渍水胁迫下施用KCl 和KNO3相比渍水胁迫能显著提高紫花苜蓿的Fv/Fm(图5)。Y(Ⅱ) 为实际光量子产量，Y(NPQ) 为PSⅡ调节性能量耗散的量子产额，而Y(NO)为PSⅡ非调节性能量耗散的量子产额，这三者之间的关系为Y(Ⅱ) + Y(NPQ) + Y(NO) = 1。渍水胁迫显著降低了紫花苜蓿的Y(Ⅱ)，同时提高了Y(NPQ)和Y(NO)，而施用KCl 和KNO3显著提高了紫花苜蓿的Y(Ⅱ)以及降低了Y(NPQ)和Y(NO)，说明施用KCl 和KNO3之后可以提高植物光化学能的利用，降低热散耗和荧光散耗。除此之外，渍水胁迫显著提高了植物的非光化学淬灭(NPQ和qN)，并降低了植物的化学淬灭(qP 和qL)，使得更多的光能以热量等形式散失，进而导致光合速率的降低，而外源施用KCl 和KNO3显著提高了紫花苜蓿的qP和qL，并降低了NPQ 和qN。ETR 为电子传递效率，单独渍水处理下紫花苜蓿的电子传递速率显著低于对照处理，而施用KCl 和KNO3之后能够提高渍水胁迫下紫花苜蓿的电子传递速率。

3 讨论

图 5 不同钾肥(KCl 和KNO3)对渍水胁迫下紫花苜蓿荧光参数的影响Figure 5 Effects of KCl and KNO3 on fluorescence parameters of alfalfa under waterlogging

水在植物的整个生命周期中起着重要的作用，是决定植物生产力的主要因素，但过多或过少的水分都不利于植物生长。南方地区降水量较多，往往会形成短暂或较长时间的渍水环境。根系是紫花苜蓿从周围环境中吸收营养成分的主要器官，也是渍水胁迫下最先受到影响的部位[3,9,13]。渍水胁迫造成土壤的缺氧环境，紫花苜蓿的根系功能受到限制，并开始变黑，腐烂，生物量显著降低，并进一步导致紫花苜蓿叶片失绿发黄[3-4,6]。而叶片是紫花苜蓿进行光合作用的主要场所[14]，叶片的失绿发黄其必然导致紫花苜蓿最大光合效率和实际光合效率的降低，从而导致紫花苜蓿生长缓慢，生物量积累减少。

钾元素常常被称为“品质元素”，可以促进叶绿素合成和光合作用相关酶的活性[15-17]。据报道，渍水胁迫下会限制植物对营养元素的吸收和利用，其中特别是氮元素和钾元素[9,18]。本研究发现，渍水胁迫下施用钾元素能够提高紫花苜蓿的叶绿素含量、最大光合效率和实际光合效率，从而促进了渍水胁迫下紫花苜蓿生物量的积累。同时，渍水胁迫下钾肥的施用能有效地保护紫花苜蓿根系，减缓了其腐烂速度，从而促进了紫花苜蓿根系生物量的积累。

氮元素也在植物的生长发育中起着至关重要的作用，植物叶绿素和蛋白质的合成均与氮元素直接相关[19-20]。硝态氮是植物可以直接吸收利用的氮素形态[19]。而传统观念中认为紫花苜蓿能够自己固定氮素，从而在一定程度上忽略了氮肥对提高紫花苜蓿抗逆性的作用。钾的施用除了可以改善植物的光合作用，还能够促进植物对硝态氮素的吸收和利用[21]。本研究发现，渍水胁迫下施用KNO3对紫花苜蓿耐渍水能力的促进作用优于KCl。其原因可能是渍水胁迫下钾元素和氮元素的同时施用更能够促进紫花苜蓿对营养元素的吸收和利用，解除了渍水胁迫紫花苜蓿造成的营养限制，为紫花苜蓿抵抗逆境环境提供了重要基础物质，促进了叶绿素的合成，减缓了光化学原件的损伤，减缓渍水胁迫所带来的影响，提高了紫花苜蓿净光合速率和生物量的积累。

4 结论

施用钾肥(KCl 和KNO3)能够有效提高渍水胁迫下的紫花苜蓿的叶绿素含量、最大光合效率和实际光合效率，从而提高紫花苜蓿的耐渍水能力。此外，KNO3对渍水胁迫下紫花苜蓿耐渍水能力的作用优于KCl，渍水胁迫下同时补充氮肥和钾肥更能够有效提高紫花苜蓿的耐渍水能力。